食管鳞状细胞癌中转移相关lncRNAs的生物学和临床相关性

王海瑞，原 翔，刘怡文，孔金玉，王 甄，赵 琪，姜志怡，高社干，常保萍

食管癌(esophageal cancer)是世界上第六大恶性肿瘤，且发病率呈逐年上升趋势[1-2]，每年的死亡人数高达40万[3]。中国的食管癌患者较多且每年新增患者占全球病例一半以上[4-6]。食管癌有两个主要的组织学类型，包括食管腺癌(esophageal adenocarcinoma,EAC)和食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)，国外以EAC多见，中国以ESCC多见[7-8]。ESCC作为食管恶性肿瘤的主要组织病理学形式，是一种存活率较低的恶性肿瘤。尽管有先进的诊断和治疗方法，但由于早期症状不明显、转移迅速，大多数病例是在疾病的晚期被诊断出来，预后较差[9]。

根据转移的情况不同，恶性肿瘤可分为局部转移阶段、区域转移阶段和远处转移阶段。与此同时，已确定远处转移阶段会导致大约50%的恶性肿瘤患者死亡[10]。因此，探究食管癌发生发展的潜在分子机制，提高治疗策略势在必行。

1 食管鳞状细胞癌的转移

转移通常表现为肿瘤细胞从原发部位转移到另一个远处部位，并适应此处的微环境，从而获得定居的过程[11]。转移可能通过以下步骤：①肿瘤细胞从原发部位转移到血液或淋巴循环；②细胞逃避凋亡，存活和停滞；③浸润到远处的靶器官；④在不同微环境中的耐受性；⑤获得增殖能力和生长，转移定植。临床上，转移也是晚期恶性肿瘤患者预后不良和死亡的主要原因。因此，了解调控转移的机制有助于改进治疗方案。

许多基因和相应的信号通路参与了转移相关事件的生物学步骤。一系列蛋白家族，如激酶、蛋白酶、趋化因子、细胞因子及其受体、血管生成因子、黏附分子等经常被报道介导肿瘤转移过程。一些重要的信号通路，包括Wnt/β-catenin、转化生长β(TGF-β)、NOTCH、JNK，已被确定为促进转移的信号通路。尽管关于转移潜在的分子事件的研究成果越来越多，但对非编码RNA对转移过程的调控却知之甚少。最近发现了一些长非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)分子，通过调节细胞通路来调节肿瘤转移过程。

2 lncRNAs

lncRNAs是长度大于200个核苷酸的无编码功能的RNA家族，是人类基因组中重要的调节分子[12]。大部分lncRNAs位于细胞核，这与lncRNAs在转录上调节基因的主要功能有关。此外，lncRNAs还在许多分子过程中发挥重要作用，如剪接和调控翻译、促进细胞增殖、细胞迁移和转移、细胞凋亡和耐药[13-21]，还可以作为早期检测的诊断生物标记物、预后不良的预测因子、治疗靶点以及转移性生物标记物[22-25]。lncRNAs是新近发现的调控食管鳞状细胞癌转移的新基因，由于其在肿瘤发生发展中的生物学功能而备受关注。一些研究表明，lncRNAs可能在食管癌的发生中起关键作用，lncRNAs在ESCC中可能作为癌基因或抑癌基因发挥作用[26-27]。同时lncRNAs可以通过激活或抑制ESCC的转移途径在转移中发挥重要作用[28]。由于lncRNAs的表达谱不同，研究转移相关的lncRNAs在转移性食管鳞状细胞癌中的表达，可能有助于从分子水平更深入地了解肿瘤的进展和转移[29]。

3 lncRNAs在食管鳞状细胞癌转移的作用机制及临床意义

越来越多的证据表明，lncRNAs通过与其他非编码RNA，特别是miRNAs的协同作用，在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。在ESCC中也研究了lncRNAs和miRNAs之间的协同作用。已有研究表明，lncRNAs可能作为“分子海绵”与miRNAs结合，从而调控针对ESCC相关基因的miRNAs。

3.1 SNHG16lncRNA小核仁RNA宿主基因16(small nuclear RNA host gene 16,SNHG16)位于17q25.1，在胃癌中首次被发现，也参与血管瘤、胶质瘤、胃癌和膀胱癌等癌症的发生发展[30-32]。目前已发现lncRNA SNHG16在ESCC的发展中有重大作用，用逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测食管鳞癌组织和细胞系中SNHG16的表达水平，结果显示在肿瘤组织中高表达。基于在线数据库分析工具，发现在食管鳞癌标本中miR-140-5p可以与SNHG16相互作用，并且miR-140-5p与SNHG16的表达水平呈负相关。此外，RIP、RNA敲低系统和双荧光素酶报告实验进一步提供了SNHG16通过其序列中含有的microRNA结合位点而直接靶向miR-140-5p的证据。生物信息学分析表明，ZEB1是食管癌miR-140-5p的靶点。验证后发现SNHG16通过与miR-140-5p竞争，作为内源性“海绵”，从而调节靶ZEB1，促进肿瘤的进展[33]。

3.2 PVT1浆细胞瘤变异易位1lncRNA(plasmacytoma variant translocation 1,PVT1)，全长1 716 nt，位于8q24.21[34]。Li PD等人研究食管鳞癌与正常组织中PVT1的表达，癌中显著上调。通过细胞功能和动物实验表明PVT1基因的敲除在体外和体内均能抑制肿瘤的生长。PVT1的沉默导致miR-203表达上调，反之亦然。此外，在PVT1基因敲除后，LASP1的表达下调，过表达的LASP1减弱了PVT1基因敲除后的抑瘤作用。结果提示PVT1通过作为miR-203和LASP1的分子海绵促进食管鳞癌的进展[35]。此外，Zheng X等采用RT-qPCR检测77例食管癌组织中PVT1的表达，发现其表达与肿瘤分期和转移有关。Transwell实验表明，上调PVT1可促进食管癌细胞的侵袭，反之亦然。Western blot分析表明，PVT1上调可能通过调节上皮向间充质转化标志物(E-cadherin，N-cadherin和vientin)的表达水平而诱导上皮向间充质转化(EMT)。此研究表明lncRNA PVT1能够通过诱导EMT来调控食管癌细胞的侵袭[25]。

3.3 CCAT1结肠癌相关转录本-1(colon cancer associated transcript-1,CCAT1)是位于染色体8q24.21上的一个11.88 kb的lncRNA。实验表明，在细胞质中，CCAT1调控HOXB13作为miR-7的分子诱饵，miR-7是一种同时针对CCAT1和HOXB13的microRNA，从而促进细胞的生长和迁移。CCAT1基因敲除在体外和体内都能显著抑制细胞的增殖和迁移。RNA-seq分析表明，CCAT1基因被敲除后，优先影响与细胞增殖、细胞迁移和细胞黏附相关的基因。因此，CCAT1/miR-7/HOXB13调控食管鳞状细胞癌的细胞迁移、侵袭和转移[36]。此外有研究表明TP63和SOX2通过激活其增强子和启动子，特异性地调节LncRNA CCAT1的表达。CCAT1的沉默在体外和体内都大大减少了细胞的生长，表现为抑制TP63或SOX2的效果。进一步研究发现CCAT1与TP63和SOX2形成复合物，通过与EGFR的增强子结合来调节EGFR的表达，从而激活MEK/ERK1/2和PI3K/AKT信号通路。这些结果共同确定了SCC特异的DNA/RNA/蛋白质复合物，它激活TP63/SOX2-CCAT1-EGFR级联反应，促进SCC肿瘤的发生[37]。

3.4 GAS5lncRNA生长停滞特异性转录本5(growth arrest-specific transcript 5,GAS5)，定位于1q25[38]，在ESCC中下调，并能减少细胞增殖。Wang K等筛选了人ESCC中受miRNA-196A调控的lncRNAs，发现GAS5在晚期ESCC患者中表达较低，进一步研究发现GAS5通过GAS/miR-196A/RISC轴在ESCC中发挥抑瘤作用，转移性ESCC中lncRNA GAS5的下调可能是miR-196A过表达所致，此信号通路轴被认为是ESCC诊断和治疗的有价值的标志[39]。一项功能研究发现，抑制miR-301a可明显减轻lncRNA GAS5的促肿瘤作用，此外，miR-301a正向调控CXCR4的表达，过表达CXCR4诱导细胞凋亡，并取消miR-301a抑制对细胞活力、迁移和侵袭的促进作用。lncRNA GAS5通过调节CXCR4和Wnt/β-catenin信号通路，在食管癌细胞中发挥抑制细胞迁移和侵袭、增加细胞凋亡的生物学作用[40]。

3.5 MEG3lncRNA母体表达基因3(maternally expressed gene3,MEG3)是由位于染色体14q32.2的DLK1-MEG3位点上的一个基因转录而来的，该lncRNA可上调p53蛋白，抑制细胞增殖[41]。Dong Z等人通过研究发现MEG3基因作为一种抑癌基因发挥作用，而异常的启动子高甲基化是食管癌MEG3基因沉默的关键。此外，MEG3作为竞争内源性RNA通过竞争性结合miR-9来调节E-cadherin和FOXO1的表达，有可能成为预测ESCC患者进展和预后的潜在生物标志物[42]。

3.6 TUSC7lncRNA肿瘤抑制候选基因7(tumor suppressor candidate 7,TUSC7)或lncRNA LOC285194被定位在染色体3q13.31上，命名为LSAMP反义RNA3(LSAMP-AS3)[43]。已有研究表明，TUSC7在食管鳞状细胞癌中显著降低，并可通过调节miR-224对细胞增殖、凋亡和化疗耐药起到调节作用。实验研究表明，TUSC7还能抑制细胞集落形成和肿瘤生长。已经证实，TUSC7的低表达与ESCC患者的总体生存率降低有关。Kaplan-Meier分析临床数据，发现TUSC7失调与包括TNM分期在内的各种临床病理特征显著相关。功能研究结果表明，TUSC7调控miR-224的表达，导致食管鳞状细胞癌细胞凋亡增加。动物实验也表明，TUSC7可以通过与EGFR/AKT信号通路相互作用来调节肿瘤的化疗耐药性[44]。

3.7 lncRNA-LET肿瘤低表达lncRNA(Long noncoding RNA-low expression in tumor,lncRNA-LET)，是一种新发现的lncRNA，定位于染色体15q24.1[45]。据报道，这种lncRNA在食管鳞状细胞癌中显著降低，并与T分期和淋巴结转移有关。上调lncRNA-LET可诱导食管癌细胞凋亡，降低癌细胞的侵袭性和增殖性[46]。此外，实验研究证实，lncRNA-LET可以诱导p53的激活。因此，提示lncRNA-LET可能通过阻滞细胞周期而在食管鳞状细胞癌的发生、转移过程中发挥抑制作用。另外有研究表明，lncRNA-LET可通过与抑癌基因p53相互作用而发挥癌基因的作用，通过直接被miR-548靶向，诱导食管鳞状细胞癌的增殖和迁移，细胞结果提示miR-548-lncRNA-let介导轴可能是食管鳞状细胞癌的治疗靶点[44]。综上所述，认为lncRNA-LET可以作为ESCC患者的一个有希望的治疗靶点和临床标志物。

4 结论

食管癌是世界上常见恶性肿瘤，发现时多为晚期，已伴有转移，预后差。尽管目前在手术、化疗和放疗方面取得进步，但食管癌患者的5 a OS率几乎没有取得令人鼓舞的改善。此外，食管鳞癌发生和发展及转移的分子机制仍不清楚。因此，迫切需要全面了解该病分子发病机制，寻找潜在的生物标志物。目前lncRNAs作为关键癌症通路的转录和转录后调控因子，已成为肿瘤学研究的热点领域。越来越多的证据表明，lncRNAs在食管癌的发生和转移中起着众多的生物学作用。已有研究表明，lncRNAs可能与不同的EMT诱导信号通路相互作用，促进肿瘤的侵袭和转移。这些通路往往与食管鳞状细胞癌转移的触发和发展有关，提示它们是潜在的治疗靶点。

本文强调了一些与转移过程相关的不同的lncRNAs及其在转移性食管鳞状细胞癌中的潜在作用。lncRNAs对转移途径的干预作用不仅可以增加对转移的主要机制的认识，还可以给出更有用的临床生物标志物。但转移相关的lncRNAs领域还处于初级阶段，要全面了解lncRNA介导的细胞信号网络及其下游靶点的调控，需要进行细致的功能研究。转移相关的lncRNAs有可能为转移性食管鳞状细胞癌患者治疗策略中的各种常见挑战打开窗口，靶向转移相关的lncRNA可能会降低转移相关患者的死亡率。