miR-24对Nod/Scid免疫缺陷小鼠中乳腺癌FE1.2细胞移植瘤生长及肺转移的抑制作用

高媛媛,李 琳,樊卫平,罗旭光,藏好晶,杨姣姣,胡 杨(山西医科大学微生物与免疫学教研室,太原 03000;山西医科大学药理学教研室;通讯作者,E-mail:huyang9@sohu.com)

乳腺癌是全世界最常见的女性恶性肿瘤[1]。当前最主要的治疗手段仍是乳房切除根治术,虽然可以有效地治愈原位癌,但对于发生远处器官转移的患者,总体治疗效果及预后欠佳,远处器官转移的并发症仍是患病后致死的主要原因[2]。microRNA(miRNA)是一类仅含有18-24个核苷酸的非编码单链小RNA[3],miRNA通过与靶基因mRNA的3′非翻译区(3′UTR)互补结合,导致靶基因mRNA降解或抑制其翻译,从而调控基因表达[4]。近年来的研究表明,miRNA在多种恶性肿瘤的增殖、迁移和侵袭的过程中发挥重要的调节作用[5]。miRNA也参与乳腺癌的发生发展,miR-21通过靶向肿瘤抑制基因原肌球蛋白1(tropomyosin 1)促进肿瘤细胞的生长[6]。研究表明,作为miRNA家族中的一员,miR-24在多种恶性肿瘤的增殖、迁移和侵袭的过程中发挥重要的调节作用,如肺癌、结肠癌、前列腺癌、胃癌、鼻咽癌等[7-10]。我们前期研究表明,与乳腺癌FE1.2细胞相比,恶性程度较低的乳腺癌FE1.3细胞miR-24表达更高。因此,我们推断高表达miR-24可能会对乳腺癌细胞产生抑制作用。本研究通过脂质体转染技术,建立了高表达miR-24的乳腺癌细胞系FE1.2-miR-24hi,并进一步验证了miR-24高表达对乳腺癌FE1.2细胞免疫缺陷鼠移植瘤生长及转移的抑制作用,为乳腺癌的早期预防及治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞系及主要试剂

乳腺癌细胞系FE1.2及FE1.3用含10%胎牛血清的MEMα培养基,于37 ℃、5% CO2无菌恒温培养箱中培养。miR-24表达载体构建及测序鉴定均由Burton B. Yang实验室(Sunnybrook Health Sciences Centre, Canada)完成并惠赠。MEMα培养基、含EDTA的0.25%胰蛋白酶购自英国Gibco公司,胎牛血清(FBS)购自美国BI公司,LipofectamineTM2000转染试剂、TRIzol、逆转录试剂盒均购自美国Invitrogen公司,PCR引物由广州锐博有限公司合成,SYBR Green Real-time PCR试剂盒购自北京全式金公司。

1.2 细胞分组及处理

为了构建miR-24高表达稳转乳腺癌FE1.2细胞并探究转染后miR-24表达情况,将miR-24高表达质粒转染的乳腺癌FE1.2细胞设为FE1.2-miR-24hi组,空载体质粒转染的乳腺癌FE1.2细胞设为FE1.2-v组,自身高表达miR-24的乳腺癌FE1.3细胞设为FE1.3组。取处于对数生长期的大鼠乳腺癌FE1.2细胞,用MEMα培养基调整细胞密度,以8×106个/孔接种至6孔板中培养过夜。按照LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书所述方法,分别将miR-24高表达质粒和空载体质粒转入乳腺癌FE1.2细胞中。转染6 h后将培养基更换为含10% FBS的MEMα完全培养基进行培养,24 h后在新鲜的完全培养液加入800 μg/ml G418进行筛选,获得miR-24高表达稳转乳腺癌FE1.2细胞及空载体稳转乳腺癌FE1.2细胞。

1.3 qPCR检测转染细胞中miR-24的表达水平

用TRIzol试剂按照说明书提取各组细胞的总RNA,用NanoDrop 2000检测所抽取RNA的浓度和纯度。按照逆转录试剂盒说明书方法将RNA逆转录为cDNA。采用qPCR试剂盒检测miR-24的表达水平,扩增条件为94 ℃ 30 s、94 ℃ 5 s、56 ℃ 15 s、72℃ 10 s,进行45个循环。qPCR的引物序列见表1。采用2-ΔΔCt法,以U6为内参计算miR-24的相对表达水平。

1.4 免疫缺陷鼠成瘤实验及肺组织肿瘤转移灶计数

取处于对数生长期的FE1.2-miR-24hi和FE1.2-v细胞,分别用PBS重悬,并调整至107个/ml的细胞悬液。10只4周龄雌性Nod/Scid免疫缺陷小鼠随机分为2组(每组5只),各取100 μl细胞悬液分别接种于小鼠的第4对乳腺脂肪垫,命名为FE1.2-miR-24hi组和FE1.2-v组。接种后每天定时观察小鼠状态,每3 d测量并计算肿瘤体积(肿瘤体积=肿瘤最长径×肿瘤最短径2)。接种25 d后,10%水合氯醛(30 μl/10 g)麻醉荷瘤小鼠,摘除肿瘤,称取移植瘤质量记录。再开胸检视胸腔腹腔转移灶,取出肺脏,4%多聚甲醛固定液固定,10倍解剖镜下计数肺转移灶后行病理切片及HE染色,光学显微镜下观察切片。

1.5 统计学处理

本研究实验结果均独立重复3次。数据采用SPSS 18.0进行统计分析,采用Graphpad Prism 5进行制图。两组间均数差异比较采用t检验,多组间数据差异比较采用单因素方差分析。以P<0.01表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-24在转染前后乳腺癌FE1.2细胞中的表达

qPCR检测结果显示,与FE1.2-v组及FE1.3组相比,FE1.2-miR-24hi组miR-24表达水平显著升高,差异具有统计学意义(均P<0.01,见图1)。证明成功建立了高表达miR-24的乳腺癌FE1.2细胞系。

2.2 miR-24对乳腺癌FE1.2细胞接种免疫缺陷鼠移植瘤生长的影响

免疫缺陷鼠移植瘤实验结果显示,在接种25 d后,小鼠第4对乳头处可见明显的肿瘤隆起(见图2),免疫缺陷鼠移植瘤模型成功建立;与FE1.2-v组相比,FE1.2-miR-24hi组移植瘤体积显著减小,质量显著降低,差异具有统计学意义(均P<0.01,见图2)。

2.3 miR-24对乳腺癌FE1.2细胞免疫缺陷鼠移植瘤肺转移的影响

免疫缺陷鼠移植瘤实验结果显示,在接种25 d后,肺部可见明显的肿瘤转移灶;与FE1.2-v组相比,FE1.2-miR-24hi组肺部转移灶数量显著减少,差异具有统计学意义(P<0.01,见图3)。肺组织切片HE染色结果显示,与FE1.2-v组相比,FE1.2-miR-24hi组肺内的肿瘤细胞转移灶数量显著减少,体积显著减小,肺泡结构破坏较少(见图3)。

3 讨论

miR-24是microRNA家族中的一员,位于染色体19p13位点,广泛存在于人类的多种组织中,发挥着调节细胞生长及凋亡的功能[11]。研究表明,在膀胱癌中,miR-24通过靶向DEDD基因抑制细胞增殖及转移[12]。骨肉瘤中,miR-24通过靶向AKT/MMP通路的Ack1抑制骨肉瘤的增殖和转移[13]。miR-24在多种良恶性肿瘤中发挥抑癌作用。在miR-24对乳腺癌调控作用的报道中,Du等[14]发现,miR-24通过靶向TPTPN9和PTPRF激活EGF信号通路促进乳腺癌的侵袭和转移;而Kang等[15]报道称,miR-24通过靶向p130蛋白抑制乳腺癌MCF7、Hep3B、B16F10、SK-Hep1和PC-3细胞的迁移、侵袭和增殖。因此,miR-24对于乳腺癌发生发展的调控作用仍然存在争议,可能在不同亚型的乳腺癌中具有不同的调控靶点。本研究所用FE1.2细胞是将载有v-Ha-ras癌基因的病毒注射到大鼠乳腺诱导获得的上皮样乳腺癌细胞[16]。在本研究中,将miR-24高表达质粒转染入乳腺癌FE1.2细胞,通过qPCR检测转染后miR-24的表达水平,成功构建了高表达miR-24的乳腺癌细胞。同时,我们将乳腺癌细胞原位种植于Nod/Scid免疫缺陷鼠第4对乳腺脂肪垫,来模拟乳腺癌原位生长及远处转移。本研究结果表明,FE1.2细胞高表达miR-24能抑制免疫缺陷鼠移植瘤的原位生长。

乳腺癌转移主要发生于肺、脑、骨和肝脏等器官,其中肺转移最为普遍,且目前没有有效的治疗方法[17]。更全面地探究乳腺癌转移机制及发掘新的治疗靶点对控制乳腺癌转移至关重要。本研究结果表明,乳腺癌FE1.2细胞远处转移主要发生在肺部,且FE1.2细胞高表达miR-24能抑制免疫缺陷鼠移植瘤向肺部的转移。

综上所述,本研究证明miR-24在FE1.2细胞乳腺癌发生发展中发挥抑制作用,但其作用机制尚未探明。在后续深入研究中,我们将探究其具体作用靶点,以期为靶向治疗乳腺癌提供新途径。