多指标-响应曲面法优选连翘叶中苷类有效部位的提取工艺

李思思,遆安航,谭丽媛,翟康欣,张淑蓉(山西中医药大学基础化学实验室,晋中 030600;通讯作者,E-mail:zhangsr62@163.com)

连翘(Forsythiasuspensa(Thunb.)Vahl)为木犀科连翘属落叶灌木植物,素有“疮家圣药”之称,其主要功效有清热解毒、疏肝行气等[1]。现代药理实验证明连翘具有抗菌、抗病毒、抗氧化及抗衰老等多种作用[2]。连翘中含有苯乙醇苷类(代表成分为连翘酯苷A)、木脂素类(代表成分为连翘苷)、黄酮类(代表成分为芦丁)等多种苷类有效成分,连翘为临床处方中常用药物[2],广泛应用于清热解毒的中药制剂中。近年来由于“非典”“甲流”“新冠”等病毒感染性疾病泛滥,连翘的市场需求剧增,但其野生资源有限。连翘叶为木犀科连翘属植物连翘的干燥叶,《本草纲目》中记载有“连翘茎叶,主治心肺积热”等[3],在我国山西、陕西等地将连翘叶作为茶饮也有较长历史,连翘叶收载于《山西省中药材中药饮片标准》(2017年),同年列入《食品安全地方标准》[4,5]。现代研究发现连翘叶中的化学成分与连翘果类似,且有些成分如芦丁和连翘苷等含量远高于连翘果[1,6],也具有与连翘果相似的抗菌、保肝、抗氧化及抗衰老等作用[7-10],连翘叶资源合理利用成为热点。本实验以连翘酯苷A、芦丁和连翘苷3种苷类有效成分为指标,采用响应曲面法对连翘叶中苷类有效部位提取工艺进行优化,为提高连翘叶中苷类有效成分的利用率提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器

Waters e2695高效液相色谱仪(苏州邦鑫电子技术有限公司);FA2104万分之一电子天平(上海精密科学仪器有限公司);AE240十万分之一电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司);H66MC超声波清洗机(无锡超声电子设备公司);HDM-500数显电热套(金坛杰瑞尔电器)。

1.2 药物与试剂

连翘叶采自山西晋中(自然阴干,经山西中医药大学中药与食品工程学院裴香萍副教授鉴定为木犀科植物连翘的干燥叶);161079-160828连翘酯苷A(中国食品药品检定研究院);161153-160831芦丁(中国食品药品检定研究院);111810-201907连翘苷(中国食品药品检定研究院);20141021色谱级甲酸(天津市光复科技发展有限公司);20140110色谱级甲醇(天津市科密欧化学试剂有限公司);20141101分析级无水乙醇(天津市北辰方正试剂厂);娃哈哈纯净水(娃哈哈集团有限公司)。

1.3 色谱条件

BDS HYPERSIL C18(色谱柱250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:甲醇(A)-水(B),梯度洗脱,程序见表1;体积流量0.8 ml/min;柱温25 ℃;检测波长288 nm;进样量为10 μl。

表1 连翘叶的梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program of Forsythia leaves

1.4 溶液的制备

1.4.1 对照品溶液的制备 取连翘酯苷A、芦丁和连翘苷对照品适量,精密称定,加甲醇制成含连翘酯苷B对照品1.52 mg/ml,连翘酯苷A对照品0.334 mg/ml和芦丁对照品0.579 mg/ml的混合对照品溶液。

1.4.2 供试品溶液的制备 精密称取连翘叶30 g,碾碎后置于1 000 ml圆底烧瓶中,加入14倍量的40%乙醇,回流提取3次,合并滤液,放冷后,确定其体积。精密量取5 ml,置于10 ml量瓶中,用40%乙醇定容至刻度线,摇匀后,取续滤液过0.45 μm微孔滤膜,即得供试品溶液。

1.5 测定法

精密吸取对照品、供试品各10 μl,使用“1.3”项下色谱条件进行测定。

1.6 线性关系考察

将混合对照品溶液精密称取,置于20 ml容量瓶中,分别精密量取1,2,3,4,5 ml置于不同的10 ml容量瓶中,使用40%乙醇稀释至刻度线,摇匀;分别进样,以各峰面积(S)为纵坐标,以对照品含量(C,μg/ml)为横坐标,绘制标准曲线。

1.7 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液10 μl,照“1.3”项下方法测定,将对照品溶液连续进样6次,计算各峰面积的相对标准偏差。

1.8 重复性试验

取20190701批次汾河连翘叶6份,按供试品制备项下方法平行制备供试品溶液6份,按照“1.3”项下色谱条件对其进行重复性考察。

1.9 稳定性试验

取“1.4.2”项下同一供试品溶液10 μl,分别于0,2,6,12,18,24 h进样测定。

1.10 加样回收试验

精密量取“1.4.2”项下已知浓度的连翘叶提取液0.5 ml共6份,分别加入一定量的混合对照品溶液,按“1.3”项下的方法进行测定,测定连翘叶提取液中各成分的平均回收率和计算RSD值。

1.11 单因素试验

以连翘酯苷A、芦丁、连翘苷的综合评分值Y(Y=连翘酯苷A含量/连翘酯苷A含量max×40%+芦丁含量/芦丁含量max×30%+连翘苷含量/连翘苷含量max×30%)为评价指标,对提取溶剂(水,20%乙醇,40%乙醇,60%乙醇,80%乙醇,100%乙醇)、提取时间(30,60,90,120,150,180 min)、溶剂加入量(8,10,12,14,16,18倍量)进行考察(n=3)。

1.12 Box-Behnken响应曲面法

以提取时间(A)、提取次数(B)、料液比(C)为影响因素,“1.11”项下综合评分值(Y)为评价指标,设计三因素三水平17组试验。

1.13 验证试验

根据曲面响应得到最优提取工艺条件为检测此方法是否稳定可靠,精密称取3份20190701批次汾河连翘叶按照最优的提取工艺进行验证。

2 结果

2.1 测定法试验结果

对照品及连翘叶样品的HPLC色谱图结果显示各峰峰型对称,分离度良好(见图1),可用于数据分析。

1.连翘酯苷A;2.芦丁;3.连翘苷图1 对照品及连翘叶样品的HPLC色谱图Figure 1 High performance liquid chromatograms of reference substance and forsythia leaf sample

2.2 线性关系结果

连翘酯苷A回归方程为Y=5 978.5X+22 074,r=0.999 6;芦丁Y=15 611X+97 581,r=0.999 9;连翘苷Y=5 540X+1 161.7,r=0.999 8;分别在0.053 2-0.532 mg/ml,0.081 6-0.645 mg/ml,0.205 4-0.818 mg/ml之间呈良好线性关系。

2.3 精密度试验结果

连翘酯苷A、芦丁和连翘苷精密度的RSD值分别为0.85%,0.73%,0.94%,均小于3%。结果表明仪器有良好的精密度。

2.4 重复性试验结果

测得连翘酯苷A、芦丁和连翘苷的重复性试验RSD值分别为1.77%,1.47%,2.39%,均小于3%。说明该方法有良好的重复性。

2.5 稳定性试验结果

连翘酯苷A、芦丁和连翘苷稳定性试验的RSD值分别为2.30%,2.29%,2.33%,均小于3%。结果表明供试品溶液在24 h内有良好的稳定性。

2.6 加样回收试验结果

连翘叶提取液中连翘酯苷A、芦丁、连翘苷的平均回收率分别为100.8%,99.7%,100.0%,RSD值分别为1.08%,0.61%,0.89%。说明该方法有良好的准确度。

2.7 单因素试验结果

根据单因素考察结果选择40%乙醇为提取溶媒;Box-Behnken响应曲面分析时,提取时间选择90,120,150 min;在溶剂加入量选择中,综合考虑成本问题,选用12倍、14倍、16倍溶剂加入量作为考察指标;提取次数一般不超过3次,所以选用1次、2次、3次为考察指标(见图2)。

图2 连翘叶提取工艺单因素考察结果Figure 2 Single factor results of extraction process investigation

2.8 Box-Behnken响应曲面结果

因素水平见表2,实验设计与结果见表3,方差分析见表4。由表4可知,因素B具有显著影响(P<0.01),因素B2具有较显著影响(0.01

表2 连翘叶提取工艺响应曲面因素水平Table 2 Response surface factor levels for Forsythia suspensa leaf extraction process

表3 连翘叶提取工艺响应曲面实验设计与结果Table 3 Experimental design and results of response surface for Forsythia leaf extraction process

表4 连翘叶提取工艺响应曲面方差分析Table 4 Variance analysis of response surface for Forsythia leaf extraction process

通过Design Expert软件对表3数据进行响应曲面分析,结果见图3。当料液比固定不变时,固定提取次数不变,随着提取时间变长,响应值缓慢降低;提取时间不变,随着提取次数增多,响应值增大(见图3A)。固定提取次数不变时,固定溶剂加入量不变,随着提取时间延长,响应值有所降低;而固定提取时间不变时,随着溶剂加入量增大,响应值先增高后降低,但趋势并不明显(见图3B)。固定提取时间不变时,溶剂加入量不变,随着提取次数增多,响应值升高;提取次数不变,随着溶剂加入量增大,响应值逐渐升高,但趋势并不明显(见图3C)。软件所得最佳提取工艺为提取时间1.5 h,提取3次,溶剂加入量为14倍时为最优工艺。

图3 连翘叶提取工艺各因素曲面响应图Figure 3 Curve response results of various factors in the extraction process of Forsythia suspensa leaves

2.9 验证试验

根据曲面响应结果选取最优提取工艺进行验证试验,精密称取连翘叶30 g,碾碎后置于1 000 ml圆底烧瓶中,加入14倍量的40%乙醇,回流提取3次,每次1.5 h,合并滤液,放冷后,确定其体积。精密量取5 ml,置于10 ml量瓶中,用40%乙醇定容至刻度线,摇匀后,取续滤液过0.45 μm微孔滤膜,通过HPLC对连翘叶中连翘酯苷A、芦丁与连翘苷的含量进行检测,对提取工艺结果进行验证。验证试验平行操作3次。实验结果见表5。最终确定提取工艺为提取时间1.5 h,提取次数3 次,料液比1 ∶14,此时,连翘叶中连翘酯苷A含量为7.73%,芦丁含量为1.07%,连翘苷含量为1.13%,综合评分值Y为98.06%。

表5 连翘叶最佳提取工艺验证试验结果Table 5 Contents of active ingredients in Forsythia suspensa leaves based on optimal extraction technology

3 讨论

现代药理学研究证明连翘叶和连翘一样,均具有抗菌、保肝、抗氧化、抗衰老等作用。在《山西省中药材中药饮片标准》亦有记述连翘叶具有清热解毒等功效[7-9]。但现阶段对连翘叶开发程度不深,并未记载药用,仅局限于连翘叶茶。连翘叶中的连翘酯苷A、连翘苷具有明确的抗菌、解热、抗氧化等药理作用,芦丁具有抗炎等功效,针对这些成分苷类结构的共同特点,故实验选用连翘酯苷A、芦丁、连翘苷为指标对连翘叶中苷类有效部位进行提取工艺研究,又因连翘酯苷A含量高且抗氧化等功效强于芦丁与连翘苷[10,11]。综合考虑,在单因素试验综合评分值Y中连翘酯苷A占40%,芦丁与连翘苷各占30%。

本研究采用单因素试验,分别考察了提取溶媒、提取时间、溶剂加入量对综合评分值Y的影响。在此基础上,通过Design Expert软件设计三因素三水平响应曲面实验,并对实验数据进行优化分析。结果显示当提取溶媒为40%乙醇,提取3次,每次1.5 h,溶媒加入量为14倍量时综合评分值最高,此时连翘酯苷A含量为7.73%,芦丁含量为1.07%,连翘苷含量为1.13%。因此利用响应面分析方法对连翘叶中苷类成分提取工艺进行优化合理可行,该方法简便、准确,易于操作,专属性强,可为后续将连翘叶开发成药品、保健品或功能食品等提供理论依据。