4-苯基丁酸对高糖诱导的人晶状体上皮细胞发生上皮间质转化的影响△

王 芳 李宝海 李 吉 叶 巍 马济远 苏静波 周 健

高血糖是导致糖尿病性白内障(DC)的主要危险因素[1-2]。长期的高血糖通过引起晶状体上皮细胞氧化应激、渗透压应激以及非酶糖基化等改变导致晶状体混浊[1]。近年的研究表明，上皮间质转化(EMT)与DC发病密切相关[3]，而内质网应激(ERS)的异常变化是触发晶状体上皮细胞发生EMT的重要因素，本课题组在糖尿病小鼠晶状体中发现晶状体上皮细胞发生EMT与ERS有关[4]。活性氧(ROS)介导的氧化应激参与包括EMT在内的众多病理生理学过程[5-6]，而ERS又可通过提高细胞内ROS水平参与调节EMT[7]。4-苯基丁酸 (4-PBA) 是一种相对分子质量较小的脂肪酸[8]，作为内质网分子伴侣，可减轻非折叠蛋白反应(UPR)，进而降低ERS水平[9-10]。本研究通过观察4-PBA对高浓度葡萄糖(简称高糖)刺激人晶状体上皮细胞系HLE-B3细胞发生EMT的影响，进一步探讨ERS诱导EMT的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料人晶状体上皮细胞系HLE-B3细胞为北京眼科研究所张炜研究员惠赠；DMEM低及高浓度葡萄糖(葡萄糖浓度为5.5 mmol·L-1、30.0 mmol·L-1)培养基、胎牛血清、2.5 g·L-1胰蛋白酶均购自美国Hyclone公司；ROS检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；实时荧光定量PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司；BCA蛋白浓度检测试剂盒、SDS-PAGE配胶、RIPA裂解液、β-actin抗体以及GAPDH抗体均购自上海碧云天生物技术有限公司；GRP78、CHOP以及p-eIF2α均购自美国Cell Signaling Technology公司；eIF2α、HRP标记的山羊抗兔IgG抗体以及HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体均购自美国Santa Cruz公司； E-cadherin、α-SMA以及Snail均购自英国Abcam公司；山羊抗兔荧光二抗购自美国Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 HLE-B3细胞的培养及处理HLE-B3细胞培养于含体积分数10%胎牛血清的DMEM低浓度葡萄糖培养基中，置于含体积分数5%CO2、37 ℃恒温培养箱中进行培养，取对数生长期、融合度70%～80%的细胞用于实验。用含体积分数0.5%胎牛血清的培养基继续孵育24 h，使细胞周期同步化。

将培养的HLE-B3细胞分为正常对照组、高糖组、4-PBA预处理+高糖组。正常对照组：细胞用含5.5 mmol ·L-1葡萄糖的DMEM培养基培养6 h；高糖组：细胞用上述DMEM培养基培养后再用30.0 mmol·L-1葡萄糖处理6 h；4-PBA预处理+高糖组：正常培养的细胞用1 mmol·L-14-PBA先处理1 h，然后用添加含30.0 mmol ·L-1葡萄糖的DMEM培养基培养6 h。各组细胞处理6 h后进行相关指标的检测。

1.2.2 各组HLE-B3细胞的形态观察将HLE-B3细胞以每孔10×103个的密度接种于特定共聚焦皿中，待细胞融合度70%～80%时，更换为含体积分数0.5%胎牛血清的培养基继续孵育24 h，使细胞周期同步化，按上述分组分别处理细胞6 h，在倒置显微镜下观察各组细胞形态学的变化。

1.2.3 流式细胞术检测各组细胞内ROS含量采用DCFH-DA法检测各组细胞内ROS的含量。取对数生长期细胞，按上述分组进行处理，培养6 h后换含10 μmol·L-1DCFH-DA的无血清培养基置于 37 ℃培养箱中孵育细胞20 min，用温PBS清洗细胞1次，2.5 g·L-1胰蛋白酶消化细胞，终止消化后制成细胞悬液。分别收集于15 mL离心管中，经1000 r·min-1离心5 min，弃上清液，再用1 mL温PBS重悬细胞，转移至EP管中，再次经1000 r·min-1离心5 min，收集细胞，用流式细胞仪检测各组细胞的荧光强度(FITC-A)。实验重复3次，取平均值。

1.2.4 实时荧光定量PCR法检测各组细胞中不同因子的相对表达量取对数生长期的HLE-B3细胞按上述分组进行处理6 h，收集细胞，按照试剂盒说明分别提取各组细胞总RNA。根据逆转录试剂盒说明书对提取的mRNA进行逆转录。其中，E-cadherin上游引物：5’-CGAGAGCTACACGTTCACGG-3’，下游引物：5’-GGGTGTCGAGGGAAAAATAGG-3’；α-SMA上游引物：5’-GGGAATGGGACAAAAAGACA-3’，下游引物：5’-CTTCAGGGGCAACACGAA-3’；Snail上游引物：5’-CCCCAATCGGAAGCCTAACT-3’，下游引物：5’-GCTGGAAGGTAAACTCTGGATTAGA-3’。 PCR反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共45个循环。每组设3个复孔，重复3次，以GAPDH为内参，采用 2-ΔΔCt计算各组细胞中不同目的基因的相对表达量。

1.2.5 Western blot 检测各组细胞中不同目标蛋白的表达取对数生长期HLE-B3细胞，按上述分组进行处理6 h，收集细胞，用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，用BCA 法检测蛋白浓度，-80 ℃保存备用。取20 μg样品，行SDS-PAGE电泳分离蛋白，采用50 g·L-1浓缩胶和100 g·L-1分离胶，电转印法将电泳条带转移到PVDF膜。将PVDF膜按照目标蛋白的相对分子质量进行裁剪，在室温下用封闭液室温封闭PVDF膜2 h，分别加入与目标蛋白相应的特异性一抗(稀释度均为1500)，4 ℃过夜，用含Tween20的PBS漂洗PVDF膜3次，每次5 min。再使用相应的HRP标记的二抗(稀释度均为13000)，37 ℃孵育1 h。用ECL化学发光法使蛋白条带显色，在凝胶成像系统下观察并测量蛋白条带的灰度值，以β-actin或GAPDH蛋白条带作为内参。实验重复至少3次，取平均值。目标蛋白表达量的相对灰度值为目标蛋白灰度值/β-actin(GAPDH)灰度值。

1.2.6 免疫荧光染色观察各组细胞中E-cadherin和α-SMA的表达将细胞接种于特定共聚焦皿中，当细胞融合度70%～80%时，按上述分组处理细胞6 h，用40 g·L-1多聚甲醛固定细胞30 min，用PBS洗5 min×3次，用体积分数1%BSA、1%TritonX-100室温封闭30 min。分别用兔抗人E-cadherin(1100)和兔抗人α-SMA(1100)孵育细胞，在4 ℃湿盒中过夜；用PBS洗10 min×3次，在室温下避光、用山羊抗兔(1200)二抗孵育2 h，经PBS洗10 min×3次后，用DAPI染细胞核15 min，再用甘油封片。在激光共聚焦显微镜下观察并采集图像。

1.3 统计学分析采用GraphPad Prism7.0数据分析软件对实验数据进行统计学分析，所有数据以均数±标准差表示，多组间均数比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，组间两两比较方差齐时用Tukey 法。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 各组细胞的形态学变化HLE-B3细胞分别经过正常、高糖、4-PBA预处理后高糖再处理6 h后发现，正常对照组HLE-B3细胞呈多边形贴壁生长，边界清晰；高糖组HLE-B3细胞呈长梭形改变，丢失上皮细胞特性，类似纤维细胞的表型；4-PBA预处理+高糖组HLE-B3细胞形态不规则，与高糖组相比，长梭形细胞数量较少(图1)。

2.2 各组HLE-B3细胞中ROS含量的变化流式细胞术检测各组HLE-B3细胞中ROS荧光强度发现，正常对照组93.2%的细胞、高糖组99.7%的细胞和4-PBA 预处理+高糖组99.8%的细胞的相对荧光强度分别为(9.30±1.07)%、(68.63±1.68)%和(22.13±0.82)%，组间比较总体差异有统计学意义(F=628.00，P<0.01)。与正常对照组和4-PBA预处理+高糖组相比，高糖组HLE-B3细胞相对荧光强度明显增加，差异均有统计学意义(t=29.76、24.81，均为P<0.01)；4-PBA预处理+高糖组HLE-B3细胞相对荧光强度稍高于正常对照组，差异有统计学意义 (t=9.501，P<0.01)。

2.3 ERS信号通路相关分子的蛋白表达变化Western blot检测结果显示，高糖组HLE-B3细胞中ERS信号通路相关分子GRP78、CHOP以及p-eIF2α蛋白的相对表达量均比正常对照组增高(均为P<0.05)，提示高糖激活细胞的ERS通路；与高糖组相比，4-PBA预处理+高糖组细胞中GRP78、CHOP及p-eIF2α的蛋白相对表达量均显著降低(均为P<0.05)，而与正常对照组相比，GRP78、CHOP及p-eIF2α的蛋白相对表达量均明显增高(均为P<0.05)(图2、表1)。

2.4 EMT标志分子的表达变化

2.4.1 各组细胞中实时荧光定量PCR检测结果实时荧光定量PCR检测结果表明，高糖组HLB-E3细胞中E-cadherin mRNA相对表达水平较正常对照组明显降低(P<0.05)，4-PBA预处理+高糖组HLB-E3细胞中E-cadherin mRNA相对表达水平较高糖组明显增高(P<0.05)，但仍比正常对照组低(P<0.05)。高糖组HLB-E3细胞中α-SMA mRNA相对表达水平较正常对照组明显升高(P<0.05)；4-PBA 预处理+高糖组HLE-B3细胞中α-SMA mRNA相对表达水平较高糖组降低(P<0.05)，同时也低于正常对照组(P<0.05)。 高糖组HLE-B3细胞中Snail mRNA相对表达水平较正常对照组明显升高(P<0.05)，4-PBA预处理+高糖组HLE-B3细胞中Snail mRNA相对表达水平较高糖组降低(P<0.05)，但仍高于正常对照组(P<0.05)(表2)。

2.4.2 各组细胞中E-cadherin、α-SMA和Snail的蛋白表达Western blot检测结果显示，各组HLE-B3细胞中E-cadherin、α-SMA和Snail的蛋白相对表达量比较，差异均有统计学意义(F=21.93、121.20、50.96；均为P<0.05)(图3)。高糖组细胞中E-cadherin蛋白相对表达量显著低于正常对照组(P<0.05)；4-PBA预处理+高糖组细胞中E-cadherin蛋白相对表达量较高糖组增高(P<0.05)，但仍低于正常对照组(P<0.05)。高糖组细胞中α-SMA 蛋白相对表达量显著高于正常对照组(P<0.05)，4-PBA预处理+高糖组细胞中α-SMA蛋白相对表达量较高糖组明显降低(P<0.05)，也低于正常对照组(P<0.05)。高糖组细胞中Snail蛋白相对表达量显著高于正常对照组(P<0.05)，4-PBA预处理+高糖组细胞中Snail蛋白相对表达量较高糖组明显降低(P<0.05)，但高于正常对照组(P<0.05)(表3)。

2.4.3 各组细胞中E-cadherin、α-SMA蛋白免疫荧光染色结果免疫荧光染色结果显示，E-cadherin蛋白在正常对照组HLE-B3细胞中呈强阳性表达，为强绿色荧光；高糖组HLE-B3细胞中E-cadherin荧光弱于正常对照组，4-PBA 预处理+高糖组HLE-E3细胞中E-cadherin荧光增强。正常对照组细胞中α-SMA蛋白呈弱阳性表达；高糖组细胞中α-SMA蛋白表达量明显高于正常对照组，为强红色荧光，4-PBA 预处理+高糖组细胞中α-SMA荧光减弱(图4)。

3 讨论

当机体受到各种外源性或内源性刺激，如氧化应激、缺血缺氧、钙平衡失调等因素的影响时，内质网稳态环境被破坏，蛋白质将无法进行正确的修饰和折叠,造成未折叠和错误折叠的蛋白分子大量堆积在内质网，当这些错误折叠的蛋白在内质网大量聚集超出内质网处理的能力时就会启动ERS[11-12]。高血糖是引起各器官损害的重要因素。有研究发现，高糖引起体外培养的晶状体上皮细胞、糖尿病小鼠晶状体上皮细胞中ERS通路相关分子GRP78、CHOP表达均增高，表明高糖诱导了ERS的发生[4,13]。

上皮细胞发生EMT是组织器官发生纤维化的重要病理基础。近年来研究表明，ERS和未折叠蛋白反应与器官纤维化相关[14-15],提示ERS与EMT也可能有密切联系。为验证ERS在高糖引起的晶状体上皮细胞发生EMT中的重要作用，本研究使用化学分子伴侣4-PBA调节HLE-B3细胞ERS反应强度，观察高糖诱导的晶状体上皮细胞发生EMT的变化。4-PBA是目前最常用的ERS抑制剂，其作用原理是通过增强内质网折叠蛋白的能力和稳定未折叠或错误折叠蛋白的构象以促进其转运，从而达到减轻ERS反应强度的目的[8，16-17]。 Baek等[18]用4-PBA预处理TGF-β1诱导的肺成纤维细胞，结果显示细胞的ERS反应强度降低，同时TGF-β1诱导的肺成纤维细胞中α-SMA、ColⅠ蛋白表达均下调，提示4-PBA通过抑制ERS反应起到减轻细胞发生EMT的作用。

GRP78是ERS的一个经典标志物之一，作为内质网的伴侣蛋白，参与内质网环境稳态的调节。当ERS显著激活时，GRP78蛋白与PERK蛋白解离，PERK蛋白磷酸化活性增强，激活下游eIF2α的磷酸化，增加CHOP的表达，引起细胞损伤[19]。本研究发现，4-PBA预处理+高糖组HLE-B3细胞中GRP78、CHOP以及p-eIF2α蛋白相对表达水平均较高糖组显著降低，但仍显著高于对照组，提示4-PBA可部分抑制高糖诱导的HLE-B3细胞ERS，这可能与4-PBA的刺激浓度较低或作用时间较短有关。值得注意的是，4-PBA抑制ERS时，高糖引起的细胞内ROS含量明显减轻。基于此，我们认为高糖激活细胞ERS使细胞内ROS含量增高并参与调节晶状体上皮细胞发生EMT。进一步研究发现， 4-PBA预处理+高糖组HLE-B3细胞E-cadherin的表达上调，α-SMA和Snail的表达下调。诱导EMT发生的重要信号是核内的转录因子Snail并使其表达上调，而Snail又能抑制上皮表型并激活间质表型表达所需要的转录基因[20-21]。因此，本研究结果提示，4-PBA通过下调ERS反应强度可有效抑制高糖诱导的晶状体上皮细胞发生EMT，反向证实了ERS参与高糖导致晶状体上皮细胞发生EMT的过程。

综上所述，本研究证实了ERS参与高糖诱导的晶状体上皮细胞发生EMT的过程，4-PBA可通过抑制ERS、减少ROS含量、抑制高糖诱导的晶状体上皮细胞发生EMT，从而对晶状体上皮细胞起到保护作用，这为寻求治疗DC的有效药物提供了一定的理论和实验依据。