肝祖细胞与肝再生的关系

王俊俊， 陆伦根， 蔡晓波

上海交通大学附属第一人民医院 消化科， 上海 200080

肝脏的再生能力极强，然而在正常情况下99%的肝细胞处于G0期。当急性肝损伤或肝大部分切除后(partial hepatectomy, PH)，残存的肝细胞迅速进入复制状态[1]。由肝细胞增殖介导的肝再生迅速而有效且通常在残存肝细胞相对健康的条件下发生，其被称为肝损伤的首要防线或生理性再生。当重症肝病时大量肝细胞死亡或慢性肝病时肝细胞衰老或复制受到抑制时，肝祖细胞(liver progenitor cell, LPC)介导的肝细胞再生称为肝脏代偿的主体，也称为肝脏再生的次要机制或病理性再生。尽管目前也有研究[2]显示，胆管细胞能在慢性肝损伤时分化为成熟肝细胞而起到肝再生作用。较多研究[3-4]均证实LPC在肝脏发育和肝损伤中存在，并可参与肝再生。本文主要阐述LPC的起源与激活，和在不同类型肝损伤中介导肝再生的作用及其调控机制。

1 LPC的起源

LPC是一种卵圆形、高核质比的细胞，位于肝实质细胞与汇管区交界的Hering’s管，从形态和体积上类似于胆管上皮细胞，被认为具有肝细胞、胆管细胞双向分化潜能，并具有以下特征：(1)具有高增殖潜力的克隆形成能力；(2)具有在培养条件下分化为肝细胞和胆管细胞的能力；(3)具有移植后的肝脏再增殖能力[5]。Farber[6]在1956年描述了第一个被鉴定为卵圆形细胞的LPC。此后在大鼠PH联合2-乙酰氨基芴介导急性肝损伤模型中证实了卵圆细胞可以分化为肝细胞[7]。其中3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dihidro-collidine(DDC)或胆碱缺乏、乙硫氨酸补充(choline-deficient ethionine-supplemmented diet, CDE)模型是使用最广泛的研究卵圆细胞的小鼠肝损伤模型[5]。LPC不仅表达干细胞标志物EPCAM、Sca-1、CD133、CD24、A6、Trop2、Lgr5、Mic1-1c3，也同时表达胆管细胞标志物SOX9、CK19及肝细胞标志物HNF4a、CK8[8]，因此被认为是双能干/祖细胞群。

然而较多文献讨论了LPC可能来自转分化的胆管细胞或肝细胞。Raven等[2]通过阻断已有肝细胞的增殖证实胆管细胞可再生肝细胞，其研究是基于Sox9表达，提出胆管细胞在肝再生过程中作为CK19+兼性干细胞，但是Sox9在胆管细胞中也表达，不能将胆管细胞与LPC区分开。同样Yimlamai等[9]研究显示在成熟的肝细胞中异位表达的YAP(Hippo途径的成员)激活了祖细胞程序，并将这些细胞转化为能够分化的祖细胞，体现肝细胞的可塑性。Wang等[10]在中心静脉附近发现了具有自我更新能力表达Axin2+的二倍体肝细胞，被认为是肝干细胞，但近期Sun等[11]研究数据反对Axin2+肝细胞是肝干细胞，并且表明整个肝脏中的肝细胞都有助于肝脏的稳态和再生。此外，最近一项研究[12]发现了表达高水平端粒酶逆转录酶的肝细胞子集，其在体内平衡过程中和损伤后有助于肝再生，并且利用谱系追踪证实了端粒酶逆转录酶高水平的肝细胞相对稀少，随机分布在整个肝小叶中，具有祖细胞特征。除了肝细胞、胆管细胞外，有研究[13]提出肝星状细胞也能成为LPC的来源。在胆管结扎和CDE诱导的肝损伤小鼠模型中，体内谱系追踪显示肝星状细胞转化为LPC参与肝再生。总之，LPC是在肝损伤过程中被激活以再生肝实质的细胞，而肝脏细胞的高度可塑性，为LPC来源提供更多可能性。

2 LPC的激活

LPC在肝脏的增殖不是独立存在的，往往与Kupffer细胞、星状细胞、血管内皮细胞以及细胞外基质形成类似小室(niche)复合体。正因为复合体的存在，LPC与肝纤维化关系密切，LPC可以产生促纤维化细胞因子而促进纤维化，而纤维化的存在也能促进LPC的增殖[14]。在多种类型的肝损伤中，表达胆管细胞标志物的细胞会从门静脉周围区域扩展到周围的薄壁组织中，这种现象称为胆管反应(ductular reaction, DR)。根据细胞来源，DR通常分为3类：(1)先前存在的肝内胆管细胞的增殖，通常见于胆道疾病，如原发性胆汁性肝硬化；(2)肝细胞的胆管样化生；(3)LPC[15]。由于慢性肝病中通常存在肝细胞的慢性损伤，因此LPC是DR的主要来源，且有研究证明LPC的激活与DR呈正相关[16]。Zhou等[17]使用NCAM、CK19、HepPar1对DR细胞染色，发现DR具有明显的双极性，即具有胆管细胞和肝细胞两个分化方向，还可不断产生多种分化状态的中间肝胆细胞，进一步说明DR是LPC的增殖形式。

3 LPC在肝损伤中的作用

3.1 急性肝损伤 Katoonizadeh等[18]研究显示, 当肝脏出现大规模坏死导致急性肝衰竭时，LPC广泛活化及DR明显出现，且肝细胞损失50%是LPC广泛活化的阈值，DR的激活是由肝损伤期间肝脏上皮细胞的再生能力受损引起的，这种激活与疾病严重程度相关，并在疾病早期(1周内)发生，但LPC需要大约1周的时间才能分化为肝细胞和胆管细胞 。根据这一理论，Weng等[19]认为大面积肝坏死患者大量肝细胞坏死的同时伴随着LPC介导的肝再生的发生，即使在急性肝衰竭情况下，患者的命运取决于LPC是否可以在短时间内再生足够的功能性肝细胞以恢复肝脏质量和功能。

3.2 慢性肝损伤 慢性肝病时肝细胞P21蛋白表达明显增加，表明肝细胞的增殖被抑制。同时，对丙型肝炎患者的研究[20]显示，LPC的增殖与患者年龄相关。因此，肝细胞的再生抑制和衰老可能是LPC成为慢性肝病肝脏再生的主要机制。在慢性肝损伤中，LPC的活化程度与炎症和纤维化程度有关[16]。最近来自小鼠模型的研究[21]显示，LPC是实质再生的重要来源，并且证明LPC在CDE肝损伤模型中对肝细胞的贡献将近30%。临床研究[22]显示，在非酒精性脂肪性肝炎患者中，LPC增殖和DR的程度与肝细胞复制阻滞、纤维化阶段和门静脉炎症严重程度密切相关。在酒精性肝炎患者中，DR增殖与疾病严重程度相关，并且DR细胞表达趋化因子和炎性介质，促进了中性粒细胞在门静脉周围区域的浸润[23]。此外一项对丙型肝炎患者的回顾性队列研究[24]显示，在疾病进展期以及原位肝移植后丙型肝炎复发期间，LPC及DR程度与肝脏炎症、纤维化显著正相关。

3.3 肝硬化 在肝硬化的实质消失区或纤维间隔中，常观察到成簇肝细胞和增殖管组成的小结节，其被认为是实质病变中的再生过程。Lin等[25]使用线粒体DNA突变作为克隆扩增的标志物，显示肝硬化中肝实质的再生结节与LPC具有相同的细胞起源，提示LPC参与肝再生。肝硬化患者中往往能观察到胆道标志物EpCAM+的肝细胞，这种中间肝胆细胞的出现可以从两种相反的角度解释：慢性损伤的肝细胞可能会获得胆管标志物的异常表达，代表了它们正在经历去分化，或者可能来自干/祖细胞分化的新生肝细胞。通过对慢性乙型和丙型肝炎患者肝脏的研究发现，EpCAM+肝细胞的程度与疾病的严重程度密切相关，并且与CK19+DR细胞相邻。此外，肝硬化EpCAM+肝细胞的端粒长度介于EpCAM-肝细胞和增生的DR细胞之间，这更支持了肝硬化时LPC向肝细胞分化的理论[26]。Stueck和Wanless[4]的研究也支持了干/祖细胞再生是肝硬化时肝脏再生的主要机制。

3.4 肝癌 LPC在肝癌发生中的作用存在长期争论，LPC被认为与肝细胞癌、肝内胆管细胞癌密切相关。对于肝细胞癌的基因芯片分析显示约20%的肝细胞癌存在胆道标志物的表达，这部分肝细胞癌被认为起源于LPC，其预后更差[27]。同时存在肝细胞癌和胆管细胞癌特征的肝细胞癌合并肝内胆管细胞癌，其癌旁LPC的增殖与预后有关。具有DR特征的细胆管癌，也被认为来源于LPC。无论对于肝细胞癌或肝内胆管细胞癌，癌旁DR均与周围组织炎症、纤维化相关，并且发现DR的增加与肝细胞癌中β-catenin核转位有关，为DR增加和肝癌预后不良之间的关系提供了解释[28]。此外有研究[29]显示在慢性肝损伤模型中抑制LPC增殖可减少肿瘤的进展。

4 LPC分化调控相关的信号通路

4.1 Wnt/β-catenin信号 Wnt/β-catenin信号与LPC分化为肝细胞有关。在接受2-乙酰氨基芴联合PH处理的大鼠中，LPC增殖阶段β-catenin活性显著增加，而在β-catenin 缺乏情况下，LPC数量急剧减少，表明Wnt/β-catenin在LPC正常活化和增殖中起关键作用[30]。Boulter等[31]研究显示，巨噬细胞吞噬肝细胞碎片诱导Wnt3a表达，激活邻近LPC中的经典Wnt/β-catenin信号，促进了LPC向肝细胞的分化。

4.2 Notch信号 Notch信号是胆管分化重要的调节分子，Alagille综合征是由先天性的Notch信号缺乏引起胆道缺失而导致胆汁淤积。在胆道再生过程中肌成纤维细胞表达Jagged1，促进了LPC中 Notch信号传递，促进了LPC分化为胆管细胞[31]。谱系追踪技术证实了Notch-RBPJ信号在胆管再生中起关键作用，还可促进体外LPC向胆管细胞分化[32]，说明Notch信号在LPC向胆管细胞分化的过程中起着核心作用。

4.3 Hippo/YAP信号 Hippo-YAP信号通路也可能参与LPC分化调控，成熟肝细胞中的YAP异位表达可将肝细胞去分化为LPC，这些LPC能增殖并分化为胆管细胞和肝细胞[9]。同样有研究[33]通过单细胞测序显示在DDC损伤模型中，胆管细胞中YAP表达具有明显异质性，并且YAP是维持胆管反应所必须的，此外还发现YAP激活受胆汁酸调节。

4.4 Hedgehog信号 PH可诱导小鼠肝脏Hedgehog配体的产生，激活Hedgehog信号，并伴随着LPC的增加和PH后纤维化的修复，而使用Hedgehog通路抑制剂会减弱PH后LPC的反应和恢复[34]。此外Hedgehog配体也直接或间接地在招募巨噬细胞中发挥关键作用，这些巨噬细胞可调节LPC向肝细胞分化[35]。

4.5 HGF/c-Met信号 肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)在诱导LPC转化为肝细胞中至关重要。HGF激活c-Met受体，从而进一步上调细胞外信号调节激酶(Erk1/2)、蛋白激酶B(AKT)和信号转导及转录激活因子3(STAT3)的表达，从而驱动LPC分化，缺乏c-Met受体，会减弱LPC增殖、分化和迁移能力[36]。且Kitade等[37]研究显示，HGF/c-Met信号能够有效激活Akt和STAT3信号通路，这是LPC向肝细胞分化所必需的，c-Met缺失导致LPC向肝细胞分化能力丧失。

4.6 TWEAK/Fn14信号 TNF类细胞凋亡诱导剂(TWEAK)是TNF超家族的成员，而成纤维细胞生长因子诱导剂14(Fn14)是TWEAK的受体，在健康肝脏中很少检测到，但在受损和再生的啮齿类动物肝脏模型中可显著诱导Fn14的表达。Jakubowski等[38]首次报道TWEAK的诱导会引起健康肝脏中LPC的激活，而TWEAK的敲减会显著降低肝损伤模型中LPC的扩增。

5 LPC移植重建肝实质

使用谱系追踪技术观察肝损伤模型中移植LPC的研究[39]显示，LPC可再生为肝细胞和胆管细胞以重建肝实质，参与肝再生。临床研究[40]将分离出EPCAM+细胞移植到终末期肝病患者，显示EPCAM+细胞的成功移植以及肝硬化严重程度的显著降低，表明了LPC在细胞治疗方法中具有巨大潜力。笔者的前期研究也同样显示脾脏注射LPC能有效缓解四氯化碳诱导的急慢性肝病中肝脏炎症、纤维化。LPC作为移植来源细胞其优势在于细胞体积小、耐受不良微环境、定向分化和增殖能力强等；然而，正常肝脏LPC数量少，关于如何促进其体外扩增、处理宿主相关免疫抑制以及LPC移植是否增加肿瘤发生风险等问题还需进一步研究。

6 小结

总之，在慢性或严重肝损伤时，LPC增殖分化为肝细胞或胆管细胞参与再生，并且在损伤过程中激活不同的信号通路调控LPC的增殖与分化。此外较多研究均证实LPC移植可改善肝脏炎症及纤维化，这将为终末期肝病患者的临床治疗提供科学依据。目前对于LPC激活、增殖及分化调控机制还缺乏充分认识，未来可深入研究LPC在不同类型肝损伤中激活、增殖及其分化条件，以及准确有效的LPC分子标志，为各种类型肝病的治疗提供新的思路。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：王俊俊负责文章结构设计，撰写文章；陆伦根负责收集、筛选文献，修改文章；蔡晓波负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。