乳腺癌中miR-221、miR-222表达水平对GATA3和FOXA1蛋白的影响及其作用机制

方煜彤，张群琛，洪超群，陈春发，陈炯玉，张任栋，吴俊东，

（1．汕头大学医学院附属肿瘤医院乳腺中心，广东 汕头 515041；2．汕头大学医学院附属肿瘤医院中心实验室，广东 汕头 515041；3．广东省乳腺癌诊治研究重点实验室，广东 汕头 515041）

miR-221和miR-222（miR-221/222）均为小分子非编码RNA，能在转录后水平调控靶基因mRNA的翻译，调节蛋白质的合成，两者均定位于X染色体，位点相差约1 kb，拥有相同的转录本和种子序列，具有高度同源性。最近的研究证实，miR-221/222的异常表达与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关。在乳腺癌中，miR-221/222在侵袭性较低的雌激素受体-α（estrogen receptor-α，ER-α）阳性乳腺癌细胞中呈低表达，而在高侵袭性ER-α阴性的基底样乳腺癌细胞呈高表达。GATA结合蛋白3（GATA binding protein 3，GATA3）和叉头框蛋白A1（fork head box protein A1，FOXA1）均为转录因子，其表达与乳腺管腔上皮细胞的发生和维持分化，以及ER-α及孕激素受体（progesterone receptor，PR）的表达密切相关。乳腺癌中miR-221/222水平与GATA3及FOXA1表达的相关性及可能的作用机制鲜见报道，因此，本研究通过茎环引物实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）技术及免疫组化方法分别检测了86例乳腺浸润性导管癌组织中miR-221/222水平与GATA3和FOXA1蛋白的表达，分析它们的相关性及临床意义；并在5种乳腺癌细胞系（MCF-7、T47D、SKBR3、MDA-MB-231和BT-549）中转染miR-221/222 mimics后，采用qPCR检测各细胞中miR-221/222的表达水平；采用Western blot检测转染后MCF-7细胞中GATA3、FOXA1、雌激素受体-α（ER-α）和钙黏蛋白E（E-cadherin）的表达；用细胞划痕和迁移侵袭实验检测转染后MCF-7细胞修复和迁移侵袭能力。从细胞水平探讨miR-221/222对GATA3和FOXA1蛋白表达的调控机制。

1 材料与方法

1.1 病例和标本

收集汕头大学医学院附属肿瘤医院2020年1月—2021年5月经手术切除的86例乳腺浸润性导管癌及其癌旁组织标本，排除有远处转移的乳腺癌患者。患者均为女性，临床病理资料完整，年龄37～71岁，中位年龄53岁；其中16例患者接受新辅助治疗后手术，70例患者初始手术治疗；根据第8版《AJCC癌症分期手册》，TNM分期Ⅰ期21例、Ⅱ期57例、Ⅲ期8例。乳腺癌组织标本取自癌灶中央组织，癌旁组织取距肿瘤边缘2 cm以外的乳腺组织。PCR检测组织采集后加入1 mL RNA later于-80℃保存；免疫组化检测组织用福尔马林固定、石蜡包埋，并切成4μm的切片组织。

1.2 细胞培养与分组转染

5种乳腺癌细胞系MCF-7、T47D、SKBR3、MDA-MB-231和BT-549均购自上海中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，分别培养于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM培养基中，置于37℃、CO体积分数为5%恒温箱中培养，根据细胞生长情况隔天更换培养基，3～4 d传代。取对数生长期的细胞接种于6孔板中，置于37℃培养箱中继续培养。当MCF-7细胞生长至铺满50%孔底面积时按照Lipofectamine 2000转染试剂（购自Invitrogen公司）说明书转染miR-221/222模拟物（miR-221/222 mimics购自中国上海吉玛制药技术有限公司）作为实验组，设未转染的MCF-7细胞为阴性对照组。

1.3 RNA提取

细胞和组织RNA提取均按照RNA提取试剂盒（北京天根生化科技公司）说明书进行。在细胞培养板中加入1 mL的TRIzol试剂，用取样器抽打若干次至溶液透明；组织标本则为取-80℃保存的标本加入1 mL的TRIzol试剂，通过冷冻型高通量组织研磨器（宁波新芝生物科技公司）进行研磨裂解处理。经氯仿振荡离心，异丙醇沉淀，75%乙醇充分漂洗，加入20μL DEPC水溶解。采用NANODROP 2000分光光度仪（赛默飞公司）测定RNA的浓度及纯度，其中

D

（260）/

D

（280）在1.8～2.2为合格，可用于后续实验。

1.4 qPCR检测组织和细胞miR-221/222的相对表达

采用茎环引物qPCR检测5种乳腺癌细胞系、转染miR-221/222 mimics的MCF-7细胞、乳腺癌组织及其配对癌旁组织中miR-221/222的表达水平。逆转录和PCR反应均按照PrimeScript试剂盒（大连宝生物工程有限公司）说明书进行，引物均由上海生工公司设计并合成，引物序列见表1。取500 ng总RNA以miR-221/222茎环RT引物1μL进行逆转录；逆转录的反应条件为37℃、15 min，85℃、5 s，4℃保持，反应结束后-20℃保存。使用CFX96荧光定量PCR仪（美国伯乐公司）进行扩增，每个样品重复3次，反应体系10 μL，反应条件：95℃、30 s；95℃、5 s，60℃、30 s，40个循环，最后72℃延伸。以U6为内参，采用相对定量法计算，以2法计算miR-221/222的相对表达水平。

表1 引物序列

1.5 免疫组化及结果判定

取石蜡切片，置于60℃温箱中孵育30 min，然后置于二甲苯中脱蜡，梯度乙醇复水。用EDTA抗原修复液进行抗原修复，冷却至室温后，用PBS漂洗切片，0.3%的HO孵育20 min以阻断内源性过氧化物酶活性。然后用羊血清封闭液处理30 min，分别加入GATA3、FOXA1一抗（美国Abcam公司，均按1∶1 000稀释）后4℃孵育过夜。次日，待切片恢复室温，用PBS漂洗，在37℃培养箱中孵化二抗酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物（中国上海基因科技公司）30 min。配制DAB显色试剂，显微镜下控制显影程度，用PBS漂洗，苏木素染色细胞核。清水漂洗后，切片置于梯度酒精和二甲苯中脱水，自然风干后用中性树胶封片。

所有染色切片均由两名资深病理科医师用双盲法独立重复阅片，以PBS代替一抗作为阴性对照，相同条件下已知阳性片作为阳性对照。GATA3和FOXA1着色部位主要在细胞核，以细胞核出现黄色或棕黄色颗粒为阳性反应，采用强度和数量积分相乘的方法进行评价。强度评分为阴性（0分）；弱阳性，浅棕色（1分）；中度阳性，棕色（2分）；强阳性，深棕色（3分）。量化评分为阴性（0分）；＜25%（1分）；25%（含）～50%（2分）；50%（含）～75%（3分）；≥75%（4分）。总分：0分阴性（-）；1～4分弱阳性（+）；5～8分阳性（++）；≥9分强阳性（+++）。-和+为低表达，++和+++为高表达。

1.6 Western blot检测蛋白的表达

采用Western blot检测对照组和转染后的MCF-7细胞中GATA3、FOXA1、ER-α、E-Cadherin的表达情况，以GAPDH为内参。收集细胞样品，加入预冷的裂解液于冰上充分裂解约30 min。将裂解液移至1.5 mL离心管中，4℃、12 000 r/min离心10 min，吸取上清液于1.5 mL离心管-80℃保存，BCA试剂盒（大连宝生物工程有限公司）检测蛋白浓度。经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，4℃下100 V恒压转膜2 h，5%脱脂奶粉中封闭非特异性抗原 1 h，分别加入GATA3或FOXA1一抗（均为美国Abcam公司，1∶1 000稀释）、ER-α一抗（北京GeneTeX公司，1∶1 500稀释）、E-cadherin一抗（北京GeneTeX公司，1∶2 000稀释）、GAPDH一抗（美国Abcam公司，1∶10 000稀释）后4℃孵育过夜。次日，加入相应二抗（美国CST公司，1∶2 000稀释），室温孵育1 h，ECL显影，化学发光成像仪曝光。

1.7 划痕实验

实验组和对照组处理同1.2，两组MCF-7细胞分别用胰蛋白酶消化后重悬计数，铺在6孔板中，每孔取2×10个细胞（孔板底部背面提前用marker笔和直尺划线，每个孔均匀划5条间隔相等的线）；等细胞生长到大约铺满90%孔底面积时，用100μL的枪头沿着6孔板背面线垂直划线，每次保持相同的力度，用PBS水轻轻洗3遍，去除划下的漂浮细胞，加入无血清培养基，划痕0、48 h后通过计算每个视野的划痕面积来观察细胞修复能力。

1.8 细胞迁移和侵袭实验

分组同1.2，两组MCF-7细胞在无血清的DMEM培养基饥饿处理12 h后分别用胰蛋白酶消化后重悬计数，取500μL（约2×10个细胞）细胞悬液加至8μm的Transwell小室（购自美国BD公司），下室为含10%FBS的培养基。侵袭实验则用含Matrigel的小室（购自美国BD公司）替代Transwell小室。继续培养48 h，用甲醛固定后以0.1%结晶紫染色，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，计算5个高倍镜视野（400倍）平均细胞数目。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 miR-221/222在乳腺癌组织中的表达水平及其与GATA3、FOXA1等表达的相关性

miR-221/222在乳腺癌中的表达水平均明显高于相应癌旁乳腺组织，差异均具有统计学意义（

P

=0.00）；miR-221/222表 达 水 平 在FOXA1、GATA3、ER-α及PR阴性表达组均显著高于阳性表达组（

P

＜0.01），见表2、图1。

表2 乳腺癌组织中miR-221/222表达水平与临床病理指标的相关性

图1 GATA3和FOXA1在乳腺癌中的表达

2.2 miR-221/222、GATA3、FOXA1表达水平与临床病理指标的相关性

miR-221/222的表达水平在高增殖指数组（Ki-67高表达）、Her-2阳性表达、三阴性分子亚型显著高于低Ki-67、Her-2阴性表达、luminal A及luminal B1型乳腺癌（

P

＜0.05）；miR-221/222的表达水平与患者的年龄、月经状况、肿块大小、淋巴结转移、组织学分级及TNM分期无明显相关关系（

P

＞0.05），而GATA3、FOXA1高表达与ER-α及PR阳性、luminal分子亚型相关（

P

＜0.05），见表2和表3。

表3 乳腺癌组织中GATA3和FOXA1表达与临床病理特征的相关性

2.3 乳腺癌细胞系中miR-221/222的表达及转染模拟物后对相关蛋白的影响

5种乳腺癌细胞系MCF-7、T47D、SKBR3、MDA-MB-231、BT-549中miR-221/222的表达情况见图2A，可见miR-221/222在MCF-7细胞中均低表达，故选择MCF-7细胞进行后续实验。在MCF-7细胞中瞬时转染miR-221/222 mimics后miR-221/222表达较阴性对照组显著升高（

P

＜0.05，图2B），且内源性的GATA3和FOXA1蛋白表达被抑制，上皮细胞相关的分子ER-α和E-cadherin表达也出现下降（图2C）。

图2 乳腺癌细胞系中miR-221/222的表达及其对相关蛋白的影响

2.4 转染miR-221/222模拟物后对MCF-7细胞修复、迁徙和侵袭能力的影响

与阴性对照组相比，MCF-7转染miR-221/222 mimics后，高表达miR-221/222的MCF-7细胞修复、迁移和侵袭能力均显著增强，差异均具有统计学意义（

P

＜0.01，图3）。

图3 转染miR-221/222 mimics后MCF-7细胞修复、迁移和侵袭能力的变化

3 讨论

近年的研究显示miR-221和/或miR-222在众多恶性肿瘤如肝细胞癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌和脑胶质细胞瘤等癌组织或癌细胞中的表达水平明显高于相应的癌旁正常组织或正常细胞。在本研究中，乳腺浸润性导管癌组织的miR-221/222也显著高于癌旁组织，与文献[11-12]报道结果一致。miR-221/222在恶性肿瘤中水平的异常增高可能通过其与靶基因mRNA的3′-UTR区互补结合，在转录后水平调控靶基因的表达，通过信号激活、细胞增殖、分化、凋亡、血管生成机制，在恶性肿瘤的发生、发展，以及侵袭迁移过程中起重要作用。

GATA3是锌指DNA结合蛋白GATA家族的成员，在乳腺癌中与ER-α的表达相关，特别是在腔内亚型（luminal）中，GATA3是调节乳腺形态发生和腔内细胞分化的必需因子。在本研究中，GATA3在ER-α/PR阳性的luminal亚型乳腺癌中的表达显著高于ER-α/PR阴性乳腺癌，与文献报道一致，GATA3蛋白的高表达与luminal亚型乳腺癌分化好、低侵袭和预后好相关。FOXA1是叉头转录因子家族的一员，也已被确定为ER-α相关调控通路的关键元件，其高表达与ER-α阳性预后好的luminal亚型乳腺癌相关，本研究结果亦显示FOXA1的高表达与ER-α/PR阳性的luminal亚型乳腺癌显著相关。GATA3和FOXA1均与雌激素受体表达相关，GATA3/FOXA1/ER-α网络是ER-α发挥功能的必需因子。而本研究在乳腺癌组织中的miR-221/222水平升高与GATA3、FOXA1的低表达以及ER-α/PR阴性表达显著相关。另外本研究在细胞水平也显示转染miR-221/222模拟物后引起GATA3、FOXA1和ERα的表达下降，提示miR-221/222对GATA3、FOXA1以及ER-α表达可能有负性调节作用。而最近的研究也发现，在乳腺癌中miR-221/222的过表达可下调ER-α的表达，而下调miR-221/222可以部分恢复ER-α的表达和对他莫昔芬的敏感性，抑制miR-221/222可以增加ER-α阳性的MCF-7细胞对他莫昔芬的敏感性。miR-221/222对GATA3、FOXA1、ER-α以及PR表达的负性调节作用及机制仍需进一步研究证实，抑制miR-221/222的表达有可能成为逆转临床上内分泌耐药的潜在治疗靶点。

本研究结果还表明miR-221/222的表达水平在高增殖指数组（Ki-67高表达）、三阴性和Her-2阳性表达分子亚型乳腺癌组织中显著高于低Ki-67、luminal A及luminal B1型乳腺癌。文献[22-23]报道miR-221/222在高侵袭性三阴性乳腺癌中显著高表达，其通过下调细胞因子信号转导抑制因子1和周期蛋白依赖性激酶抑制因子1B促进癌细胞进入S期，并通过靶向磷酸酶和张力蛋白同源物/蛋白激酶B（PTEN/Akt）通路促进乳腺癌干细胞的自我更新，从而增强了乳腺癌细胞的生长、迁移和侵袭能力。本研究发现，转染了miR-221/222模拟物的MCF-7乳腺癌细胞，其划痕修复能力和迁移侵袭能力均显著增强。另本研究结果显示，miR-221/222的表达水平在Her-2阳性表达分子亚型乳腺癌中显著升高，这与Miller等研究结果一致。在Her-2阳性乳腺癌细胞中，miR-221/222高表达水平可通过多种途径促进乳腺癌的侵袭性，Her-2还通过miR-221/222诱导ESR1下调，诱导乳腺癌细胞对内分泌治疗的耐药性。

综上所述，乳腺癌组织中miR-221/222表达水平较癌旁正常乳腺组织表达明显上调，与Her-2阳性表达、三阴性乳腺癌亚型和Ki-67高表达显著相关。乳腺癌细胞中miR-221/222高表达则GATA3和FOXA1蛋白表达被抑制，且ER-α和E-cadherin表达明显下降，划痕修复能力和迁移侵袭能力均明显增强。miR-221/222可能通过下调GATA3、FOXA1、ER-α的表达促进乳腺癌的生长、迁移和侵袭，miR-221/222可能成为乳腺癌预后判断的潜在标志物和抑制侵袭转移的潜在治疗靶点。