氧化苦参碱对小鼠肉瘤和肝癌的体内外抗肿瘤作用

刘 宁，梁兰兰，李淑芳，沈祥春，2，，梁 冰，

（1．贵州医科大学基础医学院药理学教研室，贵州 贵阳 550025；2．贵州医科大学天然药物优效利用重点实验室，贵州 贵阳 550025）

氧化苦参碱（oxymatrine，OMT）为喹嗪啶类生物碱，是传统中药苦参的主要药效成分之一。研究发现，氧化苦参碱具有抗炎、抗病毒、抗纤维化、免疫调节等多种药理作用，近年来其抗肿瘤活性广受国内外学者关注。本课题组前期观察到氧化苦参碱对环磷酰胺抗S荷瘤小鼠的增效减毒作用，发现其与环磷酰胺合用可提高抑瘤率，缓解由环磷酰胺引起的白细胞减少及肝损害。为进一步了解氧化苦参碱的抗肿瘤作用，本研究采用S和H肿瘤细胞和荷瘤小鼠进行了体内、外抗肿瘤实验，以期为氧化苦参碱的临床应用及抗肿瘤药物的开发提供参考和理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要药品与仪器

氧化苦参碱（南京昆朗医药有限公司，经本室纯化OMT含量HPLC≥90%）。

XP-75型倒置荧光显微镜（日本Olympus公司）；EXL800型酶标仪（美国BLO-TEK公司）；CO培养箱（美国Thermo Forma公司）；AB104-N型电子天平（梅特勒－托利多仪器/上海有限公司）；5810R型台式高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）。

1.2 动物与瘤株

健康清洁级（SPF）昆明种小鼠220只，雌、雄各半，雌鼠体质量18～22 g，雄鼠体质量18～22 g，由贵州医科大学实验动物中心提供，动物合格证号SYXK（黔2012－0001）。小鼠肉瘤细胞株S和小鼠肝癌细胞株H购自重庆中药研究所，常规传代培养。

1.3 氧化苦参碱对肉瘤S180和肝癌H22细胞增殖的影响[4]

采用四甲基噻唑蓝（methylthiazolyldiphenyltetrazolium bromide，MTT）法，取对数生长期S和H细胞悬液按1×10个/mL接种于96孔培养板，置37℃、CO体积分数为5%、饱和湿度条件下预培养24 h，S和H细胞实验分别设立空白对照组（RPMI-1640培养基）、阴性对照组（不加药的S和H细胞悬液）、5-氟尿嘧啶（5-FU，5×10g/L）阳性对照组及5个不同浓度（1×10、1×10、1×10、1×10、1×10g/L）的氧化苦参碱培养组，每组均设3个复孔，连续培养48 h后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液10μL。继续培养4 h，离心弃上清，每孔加入150μL DSMO，570 nm处检测吸光度，按下列公式分别计算S和H细胞的增殖抑制率。

1.4 氧化苦参碱对肉瘤S180和肝癌H22荷瘤小鼠移植瘤的影响[5]

于无菌条件下，分别将S和H瘤细胞接种于昆明种小鼠腹腔，7 d后抽取S和H荷瘤小鼠的腹水，与生理盐水按体积比1∶4进行稀释，配置成瘤细胞悬液，活细胞率大于95%。接种于同种异体小鼠右前肢腋皮下，每只小鼠注射0.2 mL（含2×10～4×10个），每次实验均用同一性别。小鼠造模24 h后，将造模小鼠均衡体质量，随机分为5组，每组10只。即模型组，氧化苦参碱高（100 mg/kg）、中（50 mg/kg）、低（25 mg/kg）剂量组，环磷酰胺（30 mg/kg）阳性对照组。另增设10只与造模组体质量相当的未接种瘤细胞悬液的小鼠作为正常对照组，各组连续8 d灌胃给药（正常对照组和模型组灌胃等体积蒸馏水），每日1次。末次给药后24 h，称取小鼠体质量，颈椎脱臼处死，剥离瘤体，称取瘤质量，计算抑瘤率。取胸腺及脾脏，称其湿质量，计算胸腺系数和脾系数。

1.5 氧化苦参碱对S180和H22腹水型荷瘤小鼠存活时间的影响

无菌条件下，腹腔分别注射S和H瘤细胞悬液于小鼠体内，每只小鼠注射0.2 mL（含2×10～4×10个细胞），共接种50只小鼠，分成5组，每组10只，次日均衡体质量后，随机分成模型组（蒸馏水），氧化苦参碱高（100 mg/kg）、中（50 mg/kg）、低（25 mg/kg）剂量组，环磷酰胺（30 mg/kg）阳性对照组，连续灌胃给药8 d，每日1次。逐日记录小鼠死亡情况，计算小鼠生命延长率。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 氧化苦参碱对肉瘤S180和肝癌H22细胞增殖的抑制作用

随着剂量的增加，氧化苦参碱（OMT）对S和H细胞增殖抑制作用逐渐增强，且存在剂量-效应关系（

r

=0.67，

r

=0.59，均为

P

＜0.05）。与模型组比较，1×10和1×10g/L的氧化苦参碱对S细胞和1×10g/L的氧化苦参碱对H细胞生长的抑制率均大于30%，差异均具有统计学意义（

P

＜0.05），见表1。

表1 氧化苦参碱（OMT）对肉瘤S180和肝癌H22细胞的增殖抑制作用

2.2 氧化苦参碱对S180和H22荷瘤小鼠移植性实体瘤的影响

与模型组比较，氧化苦参碱中、低剂量组能够显著抑制S荷瘤小鼠肿瘤的生长，抑瘤率均＞30%，差异均具有统计学意义（

P

＜0.05）；氧化苦参碱高、中剂量组能够显著抑制小鼠肝癌H的生长，抑瘤率均达到30%以上，差异均具有统计学意义（

P

＜0.05），见表2和表3。

表2 氧化苦参碱（OMT）对S180荷瘤小鼠体质量和瘤质量的影响（±s，n=10）

表3 氧化苦参碱（OMT）对H22荷瘤小鼠体质量和瘤质量的影响（±s，n=10）

2.3 氧化苦参碱对S180和H22荷瘤小鼠胸腺系数和脾系数的影响

与正常组比较，氧化苦参碱各剂量组对S和H荷瘤小鼠胸腺和脾系数无明显影响（

P

＞0.05）；环磷酰胺对照组S和H荷瘤小鼠胸腺和脾脏系数均明显降低（

P

＜0.05），见表4。

表4 氧化苦参碱（OMT）对S180和H22荷瘤小鼠胸腺系数和脾系数的影响（±s，n=10）

2.4 氧化苦参碱对S180和H22腹水型小鼠生存期的影响

与模型组比较，氧化苦参碱中剂量组可显著延长S腹水型小鼠的生存期，其生命延长百分率为31.18%，差异具有统计学意义（

P

＜0.05），见表5。

表5 氧化苦参碱（OMT）对S 180和H22腹水型荷瘤小鼠生存期的影响（±s，n=10）

3 讨论

恶性肿瘤仍是当今威胁人类健康的主要疾病。近半个世纪以来从天然植物中提取有效成分应用于临床恶性肿瘤治疗已取得令人瞩目的突破性进展，是目前恶性肿瘤综合治疗的有效手段之一。我国幅员辽阔，地处亚热带及温带，植物资源丰富，从中药特别是我国特有植物中研究、开发抗肿瘤新药早已成为广大科研工作者的目标之一。

氧化苦参碱具有较为广泛的药理活性，为研究其抗肿瘤作用，我们以S和H荷瘤小鼠为研究对象，观察了氧化苦参碱的体内外抗肿瘤作用。体外细胞培养实验结果表明，与阴性对照组相比，氧化苦参碱1×10和1×10g/L两个浓度可明显抑制小鼠肉瘤S细胞的增殖，其抑制率均大于30%，且随着剂量的增加，氧化苦参碱对S细胞生长的抑制作用增强，存在剂量-效应关系。为进一步明确其抗肿瘤作用，我们选取小鼠肉瘤S和肝癌H移植性肿瘤模型进行了在体动物实验。动物移植瘤模型因具有造模时间短、接种成功率高、均一性好等特点，广泛用于肿瘤基础研究及药物筛选，成为研究中医药抗肿瘤作用及机制的一个公认的肿瘤模型。药物对抗肿瘤是否有效，抑瘤率是经典指标之一。与模型组相比，氧化苦参碱高、中、低3个剂量组均可明显抑制S肉瘤小鼠肿瘤的生长，抑瘤率分别为48.48%、41.67%和32.58%；氧化苦参碱高、中剂量组可显著抑制肝癌H小鼠肿瘤的生长，抑瘤率分别为33.95%和31.63%，抑瘤率均大于30%，符合抗癌药筛选标准。实验过程中我们注意到，采用氧化苦参碱治疗的小鼠其饮食情况和活动情况较采用环磷酰胺治疗的小鼠要好。

从氧化苦参碱对生存期的影响来看，虽然高、低剂量组可在一定程度上延长S腹水型荷瘤小鼠的生存时间，但只有中剂量组的生命延长率大于30%，其余组与空白组比较差异无统计学意义。结合抑瘤作用的结果分析，说明中剂量组的氧化苦参碱对肉瘤S肿瘤细胞的抑制作用较强，可作为将来进一步抑瘤机制研究的参考剂量。

胸腺和脾脏是动物重要的免疫器官，胸腺系数和脾系数的大小可反映机体免疫的机能状况。氧化苦参碱给药组胸腺和脾系数与模型组相比较，差异均无统计学意义。动物体内抗肿瘤实验选用环磷酰胺作为阳性对照药物，该药物是临床上常用的肿瘤化疗药物，抑瘤作用强大，作用机制明确，但作为一种免疫抑制剂，临床应用时毒副作用较大。从动物体内实验结果来看，氧化苦参碱抑瘤效果虽不及环磷酰胺，但氧化苦参碱组的小鼠生存期较环磷酰胺组小鼠的生存期稍长，且其对脾脏、胸腺系数无明显影响，仍具有抗肿瘤作用，说明氧化苦参碱的毒性小于环磷酰胺，这正是该药物的优势所在。

综上，体外和体内抗肿瘤实验显示，氧化苦参碱具有一定的抗肿瘤作用，尚未发现其严重的不良反应以及对免疫器官的影响，说明其具有潜在的临床应用前景，苦参作为祖国传统中药，其资源丰富，可作为一种前景较好的抗肿瘤药进行研究和开发，但其确切的抑瘤机制尚待进一步深入研究。