髓核退变程度对软骨终板干细胞生物学特性的影响①

伍耀宏，王长根

(1.赣州市人民医院，江西 赣州 341000；2.寻乌县人民医院，江西 寻乌 342200)

随着经济发展的状况和人口老龄化现象的发生，腰腿痛的人群越来越多[1]，给患者的生活带来了诸多不便。目前，临床上认为椎间盘退变是引起腰腿痛的主要原因，椎间盘退变引起腰腿痛是一个复杂的病理生理过程，是由多种致病因素(年龄、遗传、职业、创伤、吸烟等)综合作用引起椎间盘细胞数量减少和功能异常，但其发病机制尚不明确[2-3]。椎间盘是由髓核、纤维环和软骨终板组成的，有研究表明能从这3种组织中分离出相应的干细胞[4-5]。鉴于此，本研究旨在探讨髓核退变程度对软骨终板干细胞生物学特性的影响。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2019年12月至2020年6月赣州市人民医院收治的脊柱退行性变患者13位。对13位患者腰椎进行MRI检查，根据Pfirrmann分级标准[6]将Ⅰ、Ⅱ级患者分为轻度髓核退变组；将Ⅲ、Ⅳ级患者分为中度髓核退变组；将Ⅴ级患者分为重度髓核退变组。轻度组患者5例，平均(35.3±4.7)岁；中度组患者4例，平均(34.2±4.6)岁；重度患者4例，平均(37.7±5.2)岁。3组患者临床一般资料无统计学差异(P>0.05)。详见表1及图1。

表1 Pfirrmann分级标准

1A：Pfirrmann分级Ⅰ级；1B：Pfirrmann分级Ⅱ级；1C：Pfirrmann分级Ⅲ级；1D：Pfirrmann分级Ⅳ级；1E：Pfirrmann分级Ⅴ级图1 病例的Pfirrmann分级

1.2 排除标准

①患有血液系统疾病者；②腰椎外伤者；③患有脊椎感染性疾病者；④合并肿瘤疾病者；⑤影像资料不全者。

1.3 方法

取3组患者的椎间盘软骨终板组织，放入含有DMEM/F12培养基的离心管中，用PBS清洗标本，分离软骨终板、髓核和纤维环，将软骨组织剪成1 mm3左右，放入0.25%胰蛋白酶在37 ℃的水浴箱10 min；0.2%Ⅱ型胶原酶和Ⅰ型胶原酶以1∶1的比列放置在37 ℃，5%CO2的培养箱中2 h，过滤得到CEMSCs；每2～3 d更换培养液，原代细胞形成单层后，加入0.25%胰蛋白酶消化，计数后按1∶3传代。

1.4 观察指标

①CEMSCs细胞活力；②CEMSCs细胞复苏能力；③CEMSCs细胞凋亡率。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 CEMSCs细胞活力

根据荧光结果显示，轻度髓核退变组患者的CEMSCs细胞活力较好，中度组患者其次，重度组患者CEMSCs细胞活力最差。详见图2。

2A：轻度髓核退变组；2B：中度髓核退变组；2C：重度髓核退变组图2 CEMSCs细胞活力免疫荧光检测

2.2 CEMSCs细胞凋亡情况

比较3组患者CEMSCs细胞凋亡情况，由实验结果可以得知，轻度组凋亡最少，中度组其次，重度组最多。详见图3。

3A：重度组；3B：中度组；3C：轻度组图3 CEMSCs细胞凋亡分析

2.3 CEMSCs细胞生物学特征

比较3组患者CEMSCs细胞生物学特征，包括细胞活力、细胞复苏活力和凋亡率，根据实验数据结果可以得知，轻度组患者的细胞活力和复苏活力均最好，中度组其次，重度组最差(P<0.05)；轻度组细胞凋亡率最低，中度组其次，重度组最高(P<0.05)。详见表2。

表2 3组CEMSCs细胞生物学特征比较

3 讨论

椎间盘是人体最大的无血管组织，其退行性变会造成椎间盘突出、椎管狭窄等问题，给患者诸多方面带来不便，虽然其机制尚不明确，但有研究表明软骨终板退行性变与椎间盘退行性变密不可分。软骨终板功能在椎间盘退变机制中发挥重要作用，终板途径是椎间盘营养通路的主要途径，任何对此通路的干扰作用，都可能是影响椎间盘代谢的潜在危险因素[7-8]，而软骨终板干细胞有修复椎间盘退变的作用[9]，因此，软骨终板结构功能改变可能是引起椎间盘退变或者加重椎间盘退变的重要因素。本文就髓核退变程度对软骨终板干细胞生物学特性的影响进行了研究。

临床上早已证实椎间盘组织内含有内源性干细胞，CEMSCs作为软骨终板的内源性干细胞，与其他外源性细胞相比，能够更好地适应椎间盘组织的内环境以及能够更好地向软骨细胞分化。软骨终板不仅是椎间盘的主要营养通路，还是维持脊柱生物力学的重要结构，其退行性变是从软骨终板开始的，软骨终板的变化在椎间盘病变中有着重要影响。由此猜测，CEMSCs细胞在椎间盘退化的过程中细胞的特性和生物学特征发生改变，这可能是导致椎间盘退变的一大重要因素。

本研究采用了新型的消化酶消化椎间盘组织来获得CEMSCs细胞，此种方法操作简单，耗时较短。本实验中，原始CEMSCs细胞传3代后，对CEMSCs细胞进行活力测定，由实验结果可以得知，髓核退变程度较轻的CEMSCs细胞荧光活性较强，说明随着髓核退变程度加深，CEMSCs细胞的活性降低。采用流式细胞术检测CEMSCs细胞的凋亡率，由实验结果可以得知，随着髓核退变程度的加深CEMSCs的凋亡率上升，说明髓核退变程度影响着CEMSCs细胞的凋亡。亦有研究表明，椎间盘内部存在的凋亡异常与年龄的大小、退变的程度有关[10]，与本实验观点一致。有学者发现软骨终板随着外在压力的增加，细胞凋亡的数量也会增加，且这种变化与MAPK信号通路有关[11]。椎间盘组织呈低氧、营养缺乏、高渗透压内环境，在这样的条件下，CEMSCs细胞易凋亡，凋亡相关蛋白BNIP3、Bax和Bak表达上调[12]。巨噬细胞迁移抑制因子是固有免疫的调控因子，在CEMSCs退变过程中高表达，可以通过与CEMSCs细胞表面CD74作用，抑制CEMSCs细胞的迁移。我们推测巨噬细胞迁移抑制因子可能是治疗软骨终板退变的新靶点。本实验还对CEMSCs细胞进行了冻存与复苏，由实验结果可以得知，轻度组患者的细胞活力和复苏活力最好，中度组其次，重度组最差，说明髓核退变程度会影响CEMSCs细胞的活力和复苏，且随着髓核退变程度的加深，CEMSCs细胞的活力和复苏活力都会有所下降。

综上所述，髓核退变程度影响软骨终板干细胞的活性、凋亡和复苏，髓核退变程度越高，软骨终板干细胞的活力越低，凋亡越多，复苏活力越弱。