豫麦158 及其硬质变异系重要性状基因的KASP 标记检测

赵永涛，张 锋，张中州，袁 谦，甄士聪，望俊森

（漯河市农业科学院，河南漯河 462300）

根据小麦胚乳质地可将小麦划分为硬质小麦、软质小麦和混合小麦。小麦籽粒硬度影响小麦的营养品质和加工品质，是评价小麦品质的一项重要指标。软质麦蛋白质含量低，磨出的面粉颗粒小，适合做馒头、饼干、糕点等；硬质麦蛋白质含量高，磨出的面粉颗粒较大，吸水能力强，适合做面包、优质面条等[1]。角质率在同一环境下可以大致反映籽粒硬度，角质率越高，籽粒硬度越高[2]。

小麦籽粒硬度主要由位于5D 染色体短臂上的主效基因Pina（Puroindoline a）和Pinb控制。夏兰芹等[3]开发了相应的分子标记并克隆了Pina和Pinb基因。籽粒硬度差异主要由Pina和Pinb基因的不同变异类型造成。含有野生型Pina和Pinb基因的籽粒表现为软质，Pina和Pinb基因任何一个发生突变，籽粒便表现为混合型或硬质。对籽粒硬度基因的研究主要采用分子标记和序列分析，近年来，KASP(Kompetitive allele specific PCR)技术也逐渐应用到小麦籽粒硬度基因分析中。KASP 可在广泛的基因组DNA 样品中，对单核苷酸多态性（SNP）或特定位点上的插入或缺失（InDel）进行精准的双等位基因判定[4]。KASP 可应用于QTL 精细定位、种子质量控制、大样本量的分子标记验证、分子辅助育种、种子资源鉴定等方面，可以在短时间内准确判断分子标记类型[5‑7]。利用KASP 可以方便地筛选出小麦有利性状基因，并指导后续品种改良，也可以对已改良品种进行基因验证[8]。

豫麦158 由漯河市农业科学院选育，于2014 年通过国家农作物品种审定委员会审定，该品种具有高产、综合抗性较好、品质较好等优点[9‑10]。豫麦158-42 为豫麦158 的自然变异系，其籽粒硬度增加，加工品质得到较大改善，达到优质强筋小麦标准，对其重要性状进行KASP 标记分析具有重要意义。为此，通过已知小麦性状相关SNP 位点，对豫麦158 和豫麦158-42 的株高、光周期、春化、粒质量、抗逆、品质等相关基因进行KASP 标记检测，分析豫麦158 和豫麦158-42 上述重要性状等位基因的异同，为小麦重要性状改良提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试小麦材料为豫麦158及其硬质变异系。豫麦158高产、稳产、综合抗性较好，其品质接近中强筋小麦标准；豫麦158-42为漯河市农业科学院超级小麦研究室于2015 年通过对豫麦158 田间选择5 200个单穗，后经考种选择种植穗行圃5 000 个，2016 年经田间调查及考种选择112 个穗系圃种植，2017 年经田间调查及考种选育出的硬质变异系，该系田间长相和豫麦158极其相似，但籽粒性状有所改变。

1.2 田间试验设计

试验于2017—2018 年在漯河市农业科学院试验基地进行，豫麦158 和豫麦158-42 播种量均为300 kg/hm2，小区面积1.5 m×6 m，其他按常规大田管理。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 农艺性状 苗期调查幼苗习性，成株期调查抗病性、成熟期、株高、成穗数、穗粒数，收获后调查产量、千粒质量、籽粒质地。按照《农作物品种区域试验技术规程小麦》（NY/T 1301—2007）进行上述指标的调查。

1.3.2 籽粒硬度及品质指标 采用单粒谷物特性测定仪（PertenSKCS4100）测定籽粒硬度，硬度指数小于40 为软质麦，大于60 为硬质麦，居两者中间为混合麦。

粗蛋白含量采用国标法（GB 5009.5—2016）测定，湿面筋含量和面筋指数采用机洗法（GB/T 5506.2—2008）测定，面团形成时间、稳定时间及吸水率和弱化度均采用粉质仪（GB/T 14490—2008）测定。

1.3.3 KASP 分析 KASP 分析由中国农业科学院作物科学研究所品质育种课题组完成，该次KASP分析包括多个单位的材料，汇总后一并完成，漯河市农业科学院超级小麦研究室选取豫麦158及豫麦158-42 进行数据分析。KASP 分析过程：选取小麦干籽粒20 粒，采用CTAB 法提取DNA。选取小麦株高、光周期、春化、品质、粒质量和抗逆等相关基因的61 对引物进行PCR 扩增。PCR 反应体系为5 μL，包括2 μL DNA(10 ng/μL)、2.5 μL 2×KASP Master Mix、0.07 μL 引物（2.5 μmol/L）和0.43 μL ddH2O。PCR 反应程序：95 ℃预热15 min；95 ℃变性20 s，65 ℃退火延伸25 s，每个循环降低1 ℃，10 个循环；95 ℃变性10 s，57 ℃退火延伸60 s，30 个循环。反应结束后，用Kluster Caller 软件对Synergy H1全功能酶标仪扫描数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 豫麦158和豫麦158-42的农艺性状

由表1 可知，豫麦158 与豫麦158-42 的农艺性状差别不大，豫麦158-42成穗数、千粒质量、产量稍低；两者籽粒性状差别明显，豫麦158 为混合麦，豫麦158-42为硬质麦。

表1 豫麦158和豫麦158-42主要农艺性状Tab.1 Main agronomic characters of Yumai 158 and Yumai 158-42

2.2 豫麦158和豫麦158-42的加工品质性状

由表2可知，与豫麦158相比，豫麦158-42品质有了较大的改善，籽粒硬度指数从43 提高到67，粗蛋白含量从13.5%提高到15.3%，湿面筋含量从29.7% 提高到35.5%，面筋指数从53.2% 提高到73.1%，弱化度从93 FU 降到了69 FU，形成时间从6.2 min 提高到10.4 min，稳定时间从7.1 min 提高到10.9 min。

表2 豫麦158和豫麦158-42加工品质性状Tab.2 Processing quality characters of Yumai 158 and Yumai 158-42

2.3 豫麦158和豫麦158-42重要性状基因的KASP标记检测

豫麦158 和豫麦158-42 的株高、光周期、春化、粒质量、抗逆、品质等相关基因的KASP 标记检测结果如表3 所示。在推广小麦品种中应用的Rht（Reduced height）基因主要有Rht-B1、Rht-D1、Rht8和Rht9，Rht-B1a表现为高秆，Rht-B1b表现为矮秆；Rht-D1a表现为高秆，Rht-D1b表现为矮秆[11]。豫麦158、豫麦158-42 均含有株高主效基因Rht-B1a和Rht-D1b，豫麦158 与豫麦158-42 株高无显著差异，田间表现为中等株高。小麦春化关键作用基因有Vrn-A1（Vernalization‑A1）、Vrn-B1、Vrn-D1，分别位于5A、5B、5D染色体长臂上，3个基因中任何一个为显性时，小麦的发育特性为春性[12]。豫麦158 和豫麦158-42 中均含有2 个春化隐性基因vrn-A1、vrn-D1，缺失春化基因Vrn-B1，均含有春化基因vrn-B3CS类型和vrn-A12147类型以及vrn-D3Jagger类型，两者还同时含有春化相关微效基因TaELF3-B1（Early flowering 3-B1）Cadenza 类型、TaELF3-D1Ria 类型、TaTOE1-B1-1（Target of eat 1‑B1‑1）Cadenza 类型和TaMOT1-D1（Molybdate transporter 1‑D1）Wild 类型，同时缺失春化相关微效基因TaFT3-B1（Flowering locus T3‑B1）。另外，两者均含有光周期基因Ppd-A1a（Photoperiod‑A1a）、Ppd-B1a和Ppd-D1b，豫麦158 及豫麦158-42 田间均表现为半冬性。共检测到18 个微效粒质量基因，豫麦158和豫麦158-42 均含有14 个高粒质量微效等位基因TaGS2-A1b（Grain size 2‑A1b）、TaGS-D1a、TaGS5-A1b、TaCwi-A1a（Cell wall‑bound invertase‑A1a）、TaCKX-D1a（Cytokinin oxidase/dehydrogenase‑D1a）、TaGW6-A1a（Grain weight 6‑A1a）、TaTGW-7Aa（Thousand grain weight‑7Aa）、TaSus-7A-1（Sucrose synthase‑7A‑1）、Hap-A、Hap-Ⅱ、Hap-6A-A、Hap-T、Hap-Ⅰ、Hap-7A-3，4 个低粒质量微效等位基因Tabas1-B1b（Plant 2‑Cys peroxiredoxin BAS1‑B1b）、TPP-6AL1b（Trehalose 6‑phosphate phosphatase‑6AL1b）、Hap-L、TaTGW6-b。

表3 豫麦158和豫麦158-42重要性状基因的KASP标记检测结果Tab.3 Detection result of important traits genes with KASP markers in Yumai 158 and Yumai 158-42

续表3 豫麦158和豫麦158-42重要性状基因的KASP标记检测结果Tab.3（Continued） Detection result of important agronomic traits genes with KASP Markers in Yumai 158 and Yumai 158-42

抗逆相关基因的KASP 标记检测结果（表3）显示，豫麦158 和豫麦158-42 均检测到5 个叶锈病相关基因Lr34-（Leaf rust 34‑）、Lr46-、Lr37-、Lr67-、Lr68-，除叶锈病主效基因Lr67-为抗病基因外，其余均为感病基因，豫麦158 和豫麦158-42 田间均表现为高感叶锈病。豫麦158 和豫麦158-42 均不含有抗赤霉病主效基因Fhb1（Fusarium head blight 1）。豫麦158 和豫麦158-42 均含有抗穗发芽基因Vp1-B1c（Viviparous 1‑B1c）、TaPHS_646（Pre‑harvest sprouting_646）、TaPHS1-prom和感穗发芽基因TaSdr-B1b（Seed dormancy‑B1b）、TaSdr-A1b。检测到5 个抗旱微效基因，豫麦158 和豫麦158-42 均同时含有4 个抗旱微效基因1-feh-w3（Fructan 1‑exohydrolase‑w3）Westonia 类型、Hap-4A-C、Hap-5D-C、TaDREB-B1a（Dehydration‑responsive element binding protein‑B1a）和1个不抗旱微效基因Hap-L。

籽粒品质相关基因的KASP 标记检测结果（表3）显示，豫麦158 和豫麦158-42 都含有1和5+10高分子质量麦谷蛋白亚基基因，两者品质均较好，豫麦158 接近中强筋小麦标准，豫麦158-42 达到强筋标准。Pinb-D1、Pina-D1基因为控制小麦籽粒硬度的主效基因，表现为软质；Pinb2则为微效基因，表现为硬质。豫麦158 同时含有Pinb-D1a、Pina-D1a、Pinb-B2a基因，而豫麦158-42 仅含有Pinb-B2a基因，缺失了小麦籽粒硬度等位基因Pinb-D1a和Pina-D1a，籽粒硬度较豫麦158 增加，而籽粒硬度与蛋白质含量、湿面筋含量、吸水率呈显著正相关关系[13]，故豫麦158-42 品质较豫麦158提高。多酚氧化酶活性、黄色素含量会影响面粉品质，豫麦158 及豫麦158-42 均检测到低多酚氧化酶基因Ppo-A1b（Polyphenol oxidase‑A1b）。豫麦158含有高黄色素基因TaZds-A1b（Zeta‑carotene desaturase‑A1b）、Psy-A1a（Phytone synthease‑A1a）、TaZds-D1a和低黄色素基因Psy-D1a（Phytone synthease‑D1a），豫麦158-42 含有高黄色素基因TaZds-A1b、Psy-A1a、Psy-D1g、TaZds-D1a。可见两者黄色素含量主效基因Psy-D1有所不同，豫麦158含有Psy-D1a，为低黄色素主效基因；豫麦158-42含有Psy-D1g，为高黄色素主效基因。胡瑞波等[14]研究发现，面粉黄色素含量与籽粒硬度呈正相关，本研究结果也间接印证了此结论。

3 结论与讨论

多种分子标记可用于小麦遗传基础分析，郑永胜等[15]采用SSR 标记对350 份小麦种质进行遗传多样性分析，把350份小麦种质划分为四大类；孔子明等[16]用芯片对小麦骨干品种周麦16 进行全基因组扫描，发现亲本周8425B 对周麦16 的遗传贡献率远大于亲本周麦9 号。本研究用KASP 技术对豫麦158 及其硬质变异系进行重要性状基因分析，较SSR 方法省时省工，较基因芯片法简单、费用低、效率高。KASP 标记检测分析结果与田间表现对应较好，用KASP 标记检测小麦农艺性状相关基因方法可行。

研究小麦某一性状受小麦复杂遗传背景的影响比较困难，人们为了研究小麦某一性状或者某一特定基因，往往利用除了目标性状不同外其他遗传背景都相同的小麦近等基因系来研究。吴新儒等[17]用导入系和SSR 标记检测选出了22 个莱州953 的AM3 单片段代换系；张建周等[18]以铭贤169 为背景构建了抗条锈基因Yrju4的近等基因系；孔忠新等[19]以望水白和川麦42 为背景构建了粒质量主效QTLQGw.nau-5A的近等基因系。本研究采用自然变异的方法选择籽粒硬度自然变异系，基因背景单纯，干扰因素少，便于开展研究。

关于籽粒硬度基因类型的研究比较多，丁茂予等[20]对85 份小麦品种的籽粒硬度基因进行分析，共检测到4 种籽粒硬度基因类型；杨子博等[21]对74 份江苏淮北地区和38 份黄淮麦区的小麦材料进行KASP 标记检测，并对所含的籽粒硬度基因型进行了分析，共检测到4 种籽粒硬度基因类型；王雪玲等[22]对66 份青海小麦品种籽粒硬度主效基因进行分析，发现66 份材料中硬度基因有5 种组合类型；张福彦等[23]对109 份黄淮麦区小麦材料进行籽粒硬度基因分析，发现所检测的硬粒小麦中含有Pinb-D1b、Pinb-D1p和Pina-D1b3 种变异类型。本研究所发现的硬质变异系豫麦158-42 与豫麦158 大多性状相同，只有籽粒性状和品质发生了变化，经过KASP 分析，重要性状基因组成变化不大，只有影响籽粒性状的硬度基因和影响品质的黄色素含量基因发生了改变，是难得的关于籽粒硬度基因的近等基因系，这为籽粒硬度研究以及分析单个硬度基因对籽粒硬度的作用或者籽粒硬度和籽粒品质关系提供了较好的材料。