碳酸氢根伞在原发性胆汁性胆管炎发病机制中的作用

常英昊， 景 丹， 徐文姣， 周晓蕾， 王孝平， 汤善宏

西部战区总医院 消化内科， 成都 610083

原发性胆汁性胆管炎(primary biliary cholangitis, PBC)是一种自身免疫性疾病，其主要病理特征为免疫系统特异性识别并杀伤肝内胆管上皮细胞，导致肝内小胆管渐进性消失，引起肝内胆汁淤积，致使肝组织反复再生并导致纤维化与肝硬化。PBC的发病机制尚未阐明，研究[1]显示PBC中胆管上皮细胞在氧化应激等有害因素作用下易于发生凋亡，凋亡细胞所产生的自身抗原可被其他胆管上皮细胞摄取并呈递给免疫系统，从而激活免疫应答并对胆管造成免疫损伤。近年来有研究[2-3]提出胆管碳酸氢根(HCO3-)伞的概念，指出胆管上皮细胞分泌HCO3-并在细胞表面形成HCO3-薄膜，HCO3-薄膜可阻挡胆汁酸自由扩散进入细胞，保护胆管上皮细胞免受疏水性胆汁酸介导的氧化应激与细胞损伤，从而减少凋亡细胞与自身抗原的产生。HCO3-伞被破坏可能是PBC发病机制的重要环节，了解HCO3-伞的产生机制与影响因素有助于阐明PBC发病机制和发现治疗靶点。现将有关PBC中胆管HCO3-伞的研究进展择要介绍如下。

1 胆管上皮细胞分泌HCO3-的生理功能

胆管上皮细胞所分泌的HCO3-在胆汁酸代谢中具有重要作用，其生理功能包括：(1)维持胆汁流动；(2)促进胆汁成分的代谢；(3)使胆汁呈碱性以促进营养物质的消化吸收；(4)在胆管上皮细胞表面形成“HCO3-伞”[4-6]。其中形成HCO3-伞并保护胆管上皮细胞免受胆汁酸损伤的功能与PBC病理生理直接相关。胆汁酸在肝细胞中由胆固醇合成，通过胆汁酸盐输出泵跨过肝细胞顶端膜排入胆管后与磷脂、胆红素等多种成分混合形成胆汁。胆管上皮细胞膜外的负电荷吸引胆汁酸盐与质子结合形成的胆汁酸，导致胆汁酸盐通过自由扩散穿越胞膜进入细胞，使其发挥细胞毒性作用并通过氧化应激等途径造成细胞损伤。胆汁酸盐通过与磷脂酰胆碱形成胶束[7-8]，可减少胆汁中具有细胞毒性的游离胆汁酸含量。尽管如此，胆管上皮细胞仍暴露在毫摩尔浓度的游离胆汁酸盐中。为防止疏水性胆汁酸盐诱导的细胞凋亡，胆管细胞具有针对胆汁酸盐的保护机制。碳酸氢盐薄膜(也称为HCO3-伞)是胆管上皮细胞的重要保护机制，碳酸酐酶催化CO2水合生成HCO3-和H+是胆管上皮细胞分泌HCO3-的主要来源，之后HCO3-通过阴离子交换蛋白(anion exchanger protein，AE)2分泌到胆汁中，Na+/H+交换蛋白将H+转运出细胞，共同调节胆汁的pH值。糖萼是胆管上皮细胞顶端膜上的糖蛋白，可富集HCO3-并在顶端膜附近形成碱性微环境，从而形成HCO3-伞[9]。HCO3-与胆汁酸发生化学反应使其脱去质子形成胆汁酸盐，从而防止胆汁酸通过自由扩散进入胆管上皮细胞并介导细胞损伤与凋亡[6]。

2 胆管上皮细胞中HCO3-分泌的相关机制

胆管上皮细胞中HCO3-的分泌受到多种因素共同调控[10]。在胆管上皮细胞中，促胰液素与乙酰胆碱分别作用于基底膜上的促胰液素受体(secretin receptor,SR)与M3毒蕈碱型受体(muscarinic type-3 receptor,M3R)激活HCO3-分泌的信号通路。促胰液素作用于SR，激活跨膜腺苷酸环化酶(tmAC)产生环磷酸腺苷(cAMP)，cAMP活化囊性纤维化跨膜电导调节器(CFTR)并将Cl-转运出细胞，由AE2在转运Cl-进入细胞的同时完成HCO3-的分泌[11]；并且CFTR活化后可促进细胞内ATP通过旁分泌作用于顶端膜上的嘌呤受体P2Y，由P2Y激活内质网上的钙离子通道3型肌醇三磷酸受体(InsP3R3)并释放Ca2+，Ca2+通过钙激活氯通道TMEM16A将Cl-转运出细胞从而促进HCO3-的分泌[12]。在完成HCO3-分泌的同时，促胰液素还可诱导cAMP和微管依赖的囊泡在细胞内迁移并将含有CFTR与AE2的囊泡定位到顶端膜，协助相关离子的转运与HCO3-的分泌[13]。乙酰胆碱作用于胆管上皮细胞基底膜外侧的M3R，M3R与G蛋白偶联并动员磷酸肌醇生成肌醇三磷酸，肌醇三磷酸与1型和2型肌醇三磷酸受体结合并释放内质网中的Ca2+进入胞浆，再通过TMEM16A增强促胰液素诱导的HCO3-分泌[9]。在上述信号通路中，Ca2+与SR等多种物质均可活化腺苷酸环化酶并产生cAMP，但由于细胞内磷酸二酯酶的存在以及cAMP具有选择性和特异性，不同信号通路所产生的cAMP只能在很小的分布范围中发挥各自的生物学效应[14]，并不会出现相互干扰的情况。

PBC患者存在胆管上皮细胞pH升高的现象。考虑到HCO3-是胆管上皮细胞调控胆汁酸碱性的主要物质，pH升高可能与HCO3-分泌障碍有关。为了解PBC患者的HCO3-分泌情况，有研究[15]采用同位素示踪法通过对注射H11CO3-的患者进行正电子发射计算机断层显像检测，结果显示在促胰液素刺激的条件下，PBC患者的HCO3-的分泌水平与健康人群相比明显降低，PBC患者胆管上皮细胞向胆汁中分泌HCO3-的功能出现异常，当PBC患者接受熊去氧胆酸(UDCA)治疗后HCO3-的分泌水平较治疗前有明显提升。并且PBC患者中cAMP刺激胆管上皮细胞分泌的HCO3-水平降低，负责Cl-/ HCO3-转运的AE2活性也出现下降。因此胆管上皮细胞的HCO3-分泌功能障碍导致HCO3-在胞内积累使得pH升高，进一步导致HCO3-伞的破坏，引起胆汁酸介导的细胞损伤与凋亡[1]。

3 PBC中胆管上皮细胞分泌HCO3-的影响因素

为进一步探究胆管上皮细胞HCO3-分泌障碍的原因，现有研究从HCO3-分泌机制着手，探索出多个可能影响胆管上皮细胞中HCO3-分泌的因素。

3.1 miR-506/AE2/sAC轴 AE2是胆管上皮细胞向胆汁中转运HCO3-的唯一通道，Brian等[16]发现AE2 mRNA在PBC患者肝脏中的表达水平明显低于在其他原因的肝硬化与胆汁淤积患者肝脏中的水平。PBC患者肝脏中AE2 mRNA水平与其血清GGT水平呈负相关，而且在接受UDCA治疗的PBC患者中，肝脏AE2 mRNA水平有所升高，介于未接受治疗患者和健康人群之间[16]，提示AE2表达降低可能与胆汁淤积有关。此外，AE基因在PBC患者其他细胞中的表达也出现异常。PBC患者的AE2基因在外周血单核细胞中的表达水平比健康人群以及其他原因的胆汁淤积或肝硬化患者更低，同时外周血淋巴细胞中AE1的mRNA水平明显升高，该现象可能是由于AE2表达下降使得AE1表达代偿性增高所致[1]。由此可见PBC患者AE2表达下降是导致胆管上皮细胞HCO3-分泌下降的原因。

为探究AE2表达下降的原因，有研究[17-18]从PBC患者异常表达的miRNA中筛选出结合于mRNA的3′端非翻译区并下调AE2表达的miR-506。miR-506表达水平在PBC患者的肝组织中升高，而在其他肝病患者的肝组织与正常肝组织中没有升高，并且PBC患者胆管上皮细胞AE2活性降低的现象可以被抗miR-506的寡核苷酸逆转。miR-506在人胆管细胞系中过度表达不仅降低AE2表达并减少HCO3-分泌水平，还使得细胞对胆汁酸盐诱导的细胞凋亡更为敏感并出现丙酮酸脱氢酶复合体E2亚单位过表达等PBC特征性改变[19]。虽然miR-506与AE2表达密切相关，但PBC患者胆管细胞、肝细胞和外周血单个核细胞都存在AE2表达下调的现象，而上述细胞中miR-506上调的现象仅在胆管细胞中出现[18,20]。此外PBC患者胆管上皮细胞在体外培养条件下仍存在miR-506上调的现象，提示miR-506上调可能与表观遗传有关。除了下调AE2表达之外，Meenakshisundaram等[20]发现miR-506也可作用于InsP3R3的mRNA 3′端非翻译区并抑制其表达，从而下调HCO3-的分泌。

AE2表达下调将导致HCO3-在胆管上皮细胞内积累，可溶性腺苷酸环化酶(sAC)[21]作为HCO3-感受器，能够被HCO3-活化并使得细胞易于发生凋亡。H69胆管细胞中AE2的敲除使得sAC表达增加，并且抑制sAC使得AE2缺陷型H69胆管细胞对多种胆汁酸盐诱导的细胞凋亡不再敏感[22]。前文提到tmAC可通过cAMP促进HCO3-的分泌，虽然sAC与tmAC同属腺苷酸环化酶家族[14]，但是二者存在诸多差异[23]：首先，sAC主要存在于胞浆、线粒体和细胞核中而tmAC主要在细胞膜上表达；其次，sAC的活化主要依赖HCO3-并由Ca2+进行微调，而tmAC则受到激活G蛋白偶联受体的细胞外信号调控；第三，sAC与tmAC存在互相拮抗的功能，sAC可促进氧化应激诱导的细胞凋亡过程并具有削弱细胞屏障的作用，tmAC则具有抑制凋亡与增强细胞屏障功能的功能。胆管上皮细胞中存在sAC与tmAC相互拮抗的平衡状态，而HCO3-的积累使sAC活性增加并通过细胞色素C和蛋白酶caspase 3相关的凋亡途径参与胆汁酸盐诱导的胆管上皮细胞凋亡。

由此可见，miR-506/AE2/sAC轴通过下调HCO3-分泌引起HCO3-在细胞内积累与HCO3-伞的破坏，最终导致胆汁酸介导的胆管上皮细胞损伤与凋亡。Chang等[23]报道了miR-506/AE2/sAC轴作为PBC重要发病机制的假说：miR-506的基因位于X染色体上，胆管细胞中X染色体连锁的表观遗传改变激活了miR-506表达，上调的miR-506从翻译水平抑制AE2表达，减少HCO3-的分泌并导致HCO3-伞的破坏，同时在胞内积累的HCO3-可上调sAC活性并促进胆汁酸诱导的胆管上皮细胞凋亡；除引起自身抗原表达外，胆管上皮细胞凋亡意味着胆道屏障破坏，可使得胆汁酸直接作用于肝细胞并造成损伤，同时胆汁酸等有毒物质导致的急性损伤迁延形成慢性炎症，持续促进细胞的氧化应激损伤与炎性细胞因子的产生，进一步上调miR-506表达，这种恶性循环最终导致胆管细胞衰老、胆管减少和肝硬化。而女性个体中由于两个X染色体均被激活，导致相关基因的表达量明显增高，造成发病率出现明显的性别差异。该假说为PBC以女性患者为主以及胆管上皮细胞凋亡并产生自身抗体等现象提供了合理解释，为揭示PBC发病机制提供了重要的理论依据。

3.2 脂多糖(LPS) 既往研究[24-25]通常认为LPS在PBC中通过Toll样受体4被胆管上皮细胞识别，激活核因子κB(NF-κB)等核转录因子并促进IL-1β、IL-6、肿瘤坏死因子α等炎性细胞因子的产生，从而激活免疫细胞并导致炎症。值得注意的是，人NF-κBp65的3′端非翻译区含有miR-506的应答序列，miR-506可下调NF-κBp65亚基的表达水平。在LPS诱导的小鼠炎症模型中，miR-506过表达并发挥改善LPS所介导炎症损伤的作用[26]。最新研究[27]发现，LPS在胆管细胞和胆管癌细胞中激活NF-κB可导致InsP3R3表达下降并影响Ca2+的释放，进而可能影响HCO3-分泌。作为PBC潜在的危险因素，LPS引起的炎症反应可能导致miR-506表达上调，从而参与下调HCO3-分泌及胆汁酸介导的细胞损伤和凋亡，LPS在PBC中的作用机制及其影响值得进一步研究。

3.3 G蛋白偶联胆汁酸受体(TGR)5 胆汁酸盐通过与胆管上皮细胞中的多种配体结合，可发挥介导Cl-和HCO3-分泌以及促进细胞增殖等生物学效应。其中胆汁酸盐通过与TGR5结合实现激活Cl-和HCO3-分泌的功能。胆汁酸盐通过作用于TGR5激活G蛋白，进一步活化腺苷酸环化酶，通过cAMP激活CFTR，启动Cl-和HCO3-的分泌过程。另外TGR5在胆管上皮细胞中还具有通过激活蛋白激酶A促进抗凋亡信号转导以及激活表皮生长因子受体促进细胞增殖等效应[3]。虽然TGR5参与了HCO3-的分泌过程，但尚未发现TGR5与PBC患者HCO3-分泌功能障碍和疾病进展是否有关。

3.4 碱性磷酸酶 碱性磷酸酶除了作为胆汁淤积与预后的标志物外，还通过介导ATP去磷酸化和调控嘌呤受体P2活性参与HCO3-的分泌过程。碱性磷酸酶的活性取决于胆管上皮细胞外pH，pH较高时催化ATP去磷酸化的活性也较高。由此可见，碱性磷酸酶介导ATP去磷酸化，抑制ATP通过旁分泌激活TMEM16A，从而下调HCO3-分泌并调控顶端膜外pH[9]。虽然碱性磷酸酶在HCO3-水平升高条件下对其分泌具有负性调控作用，但HCO3-分泌受阻时碱性磷酸酶的作用仍有待进一步研究。考虑到PBC患者广泛存在胆汁淤积现象并且碱性磷酸酶的合成与释放均增加，碱性磷酸酶对于PBC患者胆管上皮细胞HCO3-分泌的影响值得探究。

3.5 M3R抗体与Na+/H+交换蛋白 作为乙酰胆碱受体，M3R是乙酰胆碱介导胆管上皮细胞分泌HCO3-信号通路的关键环节。多数PBC患者体内存在M3R抗体[28]，推测M3R抗体可能会影响乙酰胆碱介导的HCO3-分泌，但目前尚不清楚M3R抗体在PBC中的功能。另外，有研究[29]发现PBC患者胆管上皮细胞中Na+/H+交换蛋白活性相比健康人与其他肝病患者出现下降，提示调节细胞外HCO3-水平与pH的H+转运出现异常，导致该现象出现的原因尚不清楚。目前关于M3R抗体与Na+/H+交换蛋白的研究较少，二者是否与PBC中HCO3-伞的破坏相关仍有待研究。

4 HCO3-伞与PBC治疗

作为胆管上皮细胞的重要保护机制，维持HCO3-伞的稳定并恢复其抵御胆汁酸损伤的功能对于PBC患者具有治疗价值。现有的PBC治疗药物除了调节胆汁酸代谢并降低游离胆汁酸水平外，还具有调节HCO3-分泌与修复HCO3-伞的作用。

4.1 熊去氧胆酸(UDCA) UDCA除了增加亲水性胆汁酸水平、减小胆汁酸盐的细胞毒性等作用外，也具有刺激胆管上皮细胞分泌HCO3-的作用。研究[9]显示，UDCA可通过一氧化氮相关信号通路，激活蛋白激酶PKB与磷脂酰肌醇激酶PI3K，促进CFTR依赖的ATP分泌过程，从而上调HCO3-的分泌水平并维持HCO3-伞稳定。此外UDCA同系物去甲熊去氧胆酸也具有促进HCO3-分泌的作用[30]。作为PBC的一线治疗药物，维持HCO3-伞稳定是UDCA的重要作用之一。

4.2 皮质醇类药物 尽管皮质醇类药物已被证实对PBC缺乏良好的疗效，但地塞米松与布地奈德可在胆管细胞中通过作用于糖皮质激素受体，上调AE2的表达水平从而实现促进HCO3-分泌的功能[9]。虽然皮质醇类药物疗效不佳，但也有助于维持胆道HCO3-伞的稳定。

5 结语

综上所述，HCO3-伞是胆管上皮细胞抵御胆汁酸损伤的重要保护机制。在miR-506/AE2/sAC轴等因素的作用下，HCO3-分泌障碍导致失去HCO3-伞保护的胆管上皮细胞受到胆汁酸损伤并发生凋亡的理论为PBC患者中自身抗体的产生提供了合理的解释。由于HCO3-伞可保护胆管上皮细胞免受胆汁酸介导的损伤和凋亡进而减少自身抗原的产生，维持HCO3-伞的稳定对PBC患者而言可能具有重要的治疗价值。HCO3-伞的破坏在PBC的发病机制中具有重要作用，当从免疫学角度难以解释PBC病理生理的全貌时，着眼于HCO3-分泌以及相关的胆汁酸代谢将有助于揭示PBC发生和发展的机制。

利益冲突声明:所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：常英昊负责收集分析文献与论文撰写，同时参与拟定了写作思路；景丹、徐文姣参与了收集分析文献以及论文修改；周晓蕾、王孝平参与了收集分析文献；汤善宏负责拟定写作思路，指导撰写文章与最后定稿。