慢性阻塞性肺疾病鼠类动物模型研究进展

姜友军，张培蓓，叶贤伟

(贵州医科大学附属人民医院呼吸与危重症医学科，贵阳 550002)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是以持续进行性发展的不完全可逆的气流受限为主要特征的呼吸系统疾病[1]。Wang等[2]的组织流行病学调查研究显示，我国COPD总患病人数将近1亿，约占全球COPD患者的25%。因此，通过COPD动物模型探究其发病机制、治疗措施具有重要意义。

构建动物模型是进行COPD各类研究的基础[3]，由于疾病的复杂性及不同动物品系对诱导因素的反应差异，国内外尚无公认的最佳建模方案及评价标准[4-6]。目前常用于构建COPD模型有烟草烟雾暴露[7]、空气污染物质暴露[8]、气道内炎症刺激[9]、气道内蛋白酶滴注[10]、免疫反应[10]及基因改造[11]等单因素诱导方法，以及高效的多因素联合诱导方法，不同实验中所采用的动物品系[4]及模型评价指标[5]也不同，虽然构建标准化的动物模型十分重要，但具体建模方案及评价指标仍取决于实验研究目的[6,12]。现对近年来常用的构建COPD动物模型所涉及的建模方法、模型评价进行归纳，以期为构建适用的COPD鼠类动物模型提供参考。

1 动物模型的选择

多种动物(如鼠、犬、羊、牛、猪、猴)被用于构建COPD模型[4]。研究者主要从解剖结构、基因信息、实验可行性、饲养条件及经济效能等因素综合考虑，目前较多选用鼠类(豚鼠、小鼠、大鼠等)进行研究[4-5]。

1.1豚鼠 豚鼠肺脏解剖结构及生理特征与人类大致相似，即左侧肺2叶，右侧肺3叶，具有二分叉细支气管结构，可减少吸入肺内的颗粒，大气道内有黏液腺和杯状细胞，且受神经元细胞和局部蛋白调节，对呼吸道平滑肌舒缩的激动剂和拮抗剂反应与人类相似，且变态反应、炎症反应几乎与人类相同，构建的黏液高分泌和进行性发展的COPD动物模型较其他动物更典型[3,13-16]。豚鼠对肺损伤反应大多表现为轴突反射，而轴突反射在人类肺损伤中表现并不明显[12]；此外，豚鼠价格相对较高，无可供采血和给药的尾巴，且缺乏研究分子学的工具和相关蛋白抗体，故影响研究的深入。

1.2小鼠 常见的小鼠品系有C57BL/6J、BALB/c和A/J等，不同品系、性别的小鼠对COPD动物模型诱导因素存在敏感性差异[5-6,17]。目前已明确小鼠基因信息与人类基因组接近，易制备基因改造小鼠供实验选用[18]；近交系小鼠可消除遗传变异的影响；品系多，可根据实验目的选择对诱导因素敏感性高的品系；体内存在多种酶及抗体，有利于完成抗原鉴定、免疫印迹实验、细胞流式实验、免疫组织化学等相关检测；小鼠易饲养、成本低、繁殖周期短、饲养及药物成本较低，可操作性强。但小鼠肺脏解剖结构异于人类，呈左侧肺1叶，右侧肺4叶，单轴气管分支模式[19]，支气管分支数量明显少于人类，且缺乏有呼吸功能的细支气管及定义明确的肺小叶结构[20]；气道黏膜下腺体数量少，因此不能引起黏液高分泌的病理变化[13]；且纤毛细胞分布较少，无杯状细胞。小鼠与人类的免疫应答存在差异，小鼠在停止烟草烟雾暴露后不同于人类所呈现的进行性发展的肺气肿特点[21]，但曹君等[22]发现，暴露于烟草烟雾环境3个月后，小鼠肺组织病变仍呈进行性发展。尽管如此，小鼠动物模型仍可精确复制出COPD急性加重期和慢性稳定期的重要特征[7]，如气流受限、动态肺顺应性下降等肺功能改变，气道炎症、肺气肿、气道重塑等病理改变，运动耐量下降等。

1.3大鼠 大鼠作为动物模型的优缺点与小鼠相似。与小鼠相比，大鼠静脉及气管内给药、肺组织和肺泡灌洗液等标本采集更加便利。有研究表明，大鼠对烟草烟雾暴露抵抗力较强，但Smith等[23]发现大鼠烟草烟雾暴露3 d即出现气道炎症改变，具有COPD研究价值[7]。更多的研究证实，大鼠可用于快速建立COPD模型[4-5,24]。

1.4其他鼠类 仓鼠、金黄地鼠、昆明鼠、斑点鼠等品系鼠类也被用于构建COPD模型，但因针对其的实验试剂较少、遗传变异影响等因素而受到限制[4]。

2 COPD动物模型建立方法

2.1气道吸入方法

2.1.1烟草烟雾暴露 吸烟是COPD最重要的诱因，因此常采用烟草烟雾暴露构建COPD模型[5]。烟草烟雾中含有尼古丁、焦油、一氧化碳、氮氧化物、醛类、烯烃、芳香烃等4 000多种有害物质[25]，已知有60多种物质可能参与COPD发病过程。暴露方式主要分为鼻暴露和全身暴露，周凤等[26]将小鼠全身暴露于烟草烟雾环境180 d，成功构建COPD稳定期模型。Shu等[27]发现，通过鼻暴露和全身暴露10周均成功构建COPD动物模型，但鼻暴露可控性和可重复性更强，且右心室压力变化和肺小动脉内膜增厚的病理生理特征更明显。与全身暴露导致焦油、尼古丁等有害物质附着在皮肤并进入体内的缺点相比，鼻暴露能更准确地控制烟雾吸入量，有助于准确判断干预效果，且符合人类吸烟过程，可产生更多表型，实验重复性更稳定[28-29]。单纯烟草烟雾暴露是较为理想的建模方法，一般暴露2个月可出现气道炎症等早期COPD病理改变，6个月则出现典型的COPD病理及功能改变，如气道炎症、气道重塑、肺气肿、肺功能下降[15]。但短时间内单纯烟草烟雾暴露很难引起明显的肺泡腔扩大、气道重塑及肺功能下降等特征，且不同实验中的烟草烟雾暴露设备、时间、烟雾浓度(总颗粒物密度、氧气浓度、二氧化碳浓度)等不同[5,30]。单纯烟草烟雾暴露构建COPD模型所需时间长，且暂缺标准烟草烟雾暴露方案。

2.1.2空气污染物质暴露 空气污染物暴露与COPD的发生、发展联系紧密，空气污染物浓度与COPD患者住院水平呈正相关[31-33]。有研究证实，将实验小鼠或大鼠暴露于可吸入颗粒物质(particulate matter，PM)和(或)有害气体环境均可成功构建COPD模型[34-39]。PM是空气污染的主要成分，其中PM2.5被认为在COPD发病机制中起关键作用。Zhao等[34]将小鼠全身暴露于PM2.5(560 μg/m3)中，40周后出现肺气肿、气道慢性炎症等病理改变，建模成功。刘菁等[35]发现，通过吸入PM2.5颗粒和气管内滴注PM2.5混悬液建模3个月后，两组均出现典型COPD特征，气管内滴注PM2.5混悬液组以急性肺损伤为主，故认为PM2.5颗粒暴露更适合构建COPD模型。He等[36]将大鼠分别暴露于生物质燃料、机动车尾气毒染的空气中，含有PM、一氧化碳、氮氧化物、二氧化硫等有害物质，7个月后建模成功。单纯有害气体暴露(如二氧化硫、二氧化氮和臭氧)也可构建COPD模型[37-39]。该动物模型可用于探究空气污染物参与诱发COPD的发病机制以及长期空气污染物暴露所导致的肺脏病理生理改变。但是空气污染物建模方法耗时长，对污染物定量及暴露条件的要求较高，且较难控制污染物的稳定浓度。

2.2气道内滴注方法

2.2.1气道内滴注病原体或病原体相关成分 病原体感染是COPD急性加重的主要诱因，急性加重次数与肺功能下降速度呈正相关[40-41]。气道内病原体及病原体所产生的损害因素[如脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、肽聚糖及酶类]刺激气道和肺实质、诱导炎症细胞浸润并释放炎症介质，进而诱发炎症反应，最终发展为COPD[42]。目前常被用于构建COPD模型的病原体有铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、流感病毒等；LPS是革兰阴性菌的细胞壁成分，常存在于空气污染物及有机粉尘中。文文等[43]给予大鼠气道反复滴注铜绿假单胞菌菌液，第2周气管壁及伴行血管壁开始增厚，第16周可见中央多个肺泡相互融合、肺泡腔不规则扩大、肺泡间隔断裂、肺大疱等典型肺气肿表现。Kobayashi等[9]给予小鼠气道内滴注LPS，暴露后第1天气道内巨噬细胞明显增高，第3天气道内总体炎症水平最高，符合COPD急性加重期表现。气道内滴注建模方案中，干预因素及剂量相对明确，常通过单因素或联合其他诱导因素构建COPD急性加重期模型；单次给药干预后，早期出现明显气道炎症反应，但未见明显的气道重塑、肺气肿等病理特征[9]，需多次给药，但与其他模型相比，该建模方法所需时间仍较短[9,44-46]。

2.2.2气道内滴注蛋白酶 吸烟、氧化应激、气道炎症反应均可导致蛋白酶-抗蛋白酶失衡，引起肺组织损伤，最终出现肺气肿改变。在弹性蛋白酶诱导COPD模型过程中，除直接肺损伤外，还存在炎症反应机制[10]。常用的蛋白酶有猪胰蛋白酶、人中性粒细胞弹性蛋白酶、木瓜蛋白酶等。Shibata等[47]予BALB/c小鼠鼻内单次滴注猪胰蛋白酶，第7天小鼠肺部出现明显的肺气肿征象，第21天肺泡平均线性截距增加2倍以上，符合COPD特征。该方法建模时间短[48]，诱导因素明确、药物剂量易控制，肺泡破坏程度与蛋白酶剂量呈正相关，可构建重度COPD动物模型，暴露后肺组织破坏呈进行性发展[9]；但蛋白酶给药剂量窗狭窄，不同动物品系对蛋白酶存在敏感性差异[49]。

2.3腹腔内注射方法

2.3.1腹腔内注射烟草烟雾提取物(cigarette smoke extract，CSE) CSE几乎含有烟草烟雾中的所有化合物[50]。近年来，研究者通过腹腔注射CSE成功构建COPD动物模型[51-52]。He等[51]自制CSE溶液，于第1、12、23天以0.3 mL/20 g的剂量注入小鼠腹腔，12周后，小鼠肺功能下降、肺泡腔扩大、肺泡破坏、肺泡间隔细胞凋亡增加，符合肺气肿模型，与单纯烟草烟雾暴露相比无明显差异。Chen等[52]于第1、8、15天向大鼠腹腔注入1 mL CSE溶液，3周诱导出肺气肿模型。该方法建模时间较短、CSE易制备、操作简单、价格低，但尚无烟草种类、CSE制备方法、给药时机的公认方案，且具体病理生理机制尚不明确，可能与血管重塑、气道高反应[50]、氧化应激、白细胞介素-6水平增高[51]等机制相关。

2.3.2腹腔内注射异种内皮细胞 体液免疫和细胞介导的免疫调节失衡可能参与肺组织破坏、肺泡细胞凋亡和肺气肿的发展[53]。Taraseviciene-Stewart等[54]首次采用大鼠腹腔内注射人脐静脉内皮细胞，2～3周后发现，抗内皮细胞抗体增多，并出现肺泡细胞凋亡及小叶中央型肺气肿病理改变，证实体液免疫和细胞介导免疫参与了COPD的发病机制。有学者应用弹性蛋白酶[10]、α-半乳糖基神经酰胺[55]验证了自身免疫调节机制诱导COPD形成，并探讨了先天性和适应性免疫调节机制在COPD动物模型中的作用[56]。腹腔内注射异种内皮细胞构建自身免疫型肺气肿模型较为常用[57]，建模时间较短，以肺泡凋亡、肺泡腔扩大为主要表现，但无明显气道炎症、气道重塑病理改变，且操作过程相对复杂。

2.4皮下注射方法 血管内皮生长因子是内皮细胞生存所必需的营养因子，在肺组织中大量表达，以维持成人肺组织结构[58]。血管内皮生长因子受体2表达减少导致肺泡间质细胞凋亡增加，最终导致肺气肿[59]。Kasahara等[58]予大鼠皮下注射血管内皮生长因子受体阻滞剂(SU5416 20 mg/kg，每周3次)，3周后出现肺泡间隔结构消失、肺泡腔扩大等肺气肿病理改变，证实了内皮细胞破坏、血管内皮生长因子与肺气肿的相关性。Bilan等[60]予大鼠单次皮下注射SU5416 200 mg/kg，26 d后出现肺泡细胞凋亡、肺泡腔扩大等肺气肿表现，合并肺动脉高压及肺血管损伤。该建模方法可建立肺气肿并肺动脉高压、肺血管损害相关模型[61]，但其与人类肺气肿合并肺动脉高压、肺血管损害发生发展机制的相似性仍需深入研究。

2.5基因改造方法 吸烟是最重要的COPD诱导因素，但并非所有吸烟者均患病，因而个体易患因素逐渐受到重视。最新研究表明[18]，基因决定因素与COPD发病、COPD相关表型及肺功能变化相关，在基因改造小鼠模型中，大约有119个基因、84个COPD基因位点显示COPD相关表型；位于COPD全基因组关联研究位点的8个基因(刺猬相互作用蛋白、家族序列相似性13A、铁反应元件结合蛋白2、晚期糖基化终末产物受体、基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶12、表面活性蛋白D和衰老关键蛋白5)也表现为小鼠COPD表型，可能是COPD易感基因。基因工程技术应用前，常选用自然基因突变形成的自发性COPD模型，如紧皮、苍白、米色、斑点型小鼠，但这些基因突变的病理生理影响并不局限于肺脏。目前多选用基因改造技术调控基因序列，以增强或减弱相关蛋白的表达，通过诱导蛋白酶/抗蛋白酶机制失衡、增加诱导因素易感性等构建COPD模型。Shuto等[62]应用基因工程技术改造小鼠相关基因，以诱导气道上皮Na+通道b亚基表达增强，成功建立Na+通道b亚基COPD小鼠模型，并证实蛋白酶-抗蛋白酶失衡和氧化应激是该小鼠模型的主要病理生理特征，以探讨丝氨酸蛋白酶抑制剂和抗氧化剂对COPD的潜在作用。Jiang等[63]构建家族序列相似性13A-/-小鼠，并与同等暴露于烟草烟雾中的家族序列相似性13A+/+小鼠进行比较发现，前者对烟草烟雾暴露有抵抗能力，证实家族序列相似性13A基因为COPD易感基因。Richmond等[64]发现，聚合免疫球蛋白受体缺陷小鼠气道内分泌型免疫球蛋白A分泌减少，导致呼吸道对常驻肺微生物区系的先天免疫反应的持续激活，进而出现进行性小气道重塑和肺气肿改变。目前已有α1抗胰蛋白酶、转化生长因子-β等基因改造动物模型可供选用[12]，该模型具有遗传稳定性及重复性，可从分子水平分析特定基因的作用及功能，探索免疫及基因靶向治疗；但COPD非单基因致病，具有罕见表型，建立符合人类COPD基因组的动物模型仍需深入研究。

2.6多种方法联合

2.6.1以烟草烟雾暴露为主 单纯烟草烟雾暴露构建COPD模型耗时长，多用于构建COPD稳定期表型；目前多采用烟草烟雾暴露联合方案，可有效缩短建模时间，建立COPD急性加重期表型。如联合应用气道内滴注病原体[46,65]、LPS[26-27]、弹性蛋白酶[48,66]、PM2.5混悬液滴注[67]，腹腔内注射CSE[30]等。

2.6.2以气管内滴注LPS为主 单纯气管内滴注可诱发气道内急性炎症反应，可联合其他诱导因素加强诱导肺组织的形态结构改变，缩短建模时间，并模拟具有气道炎症反应、气道重塑、肺气肿表现的典型COPD特征的动物模型，如气管内滴注LPS+蛋白酶[9]、LPS+CSE[68]、LPS气管内滴注+烟草烟雾暴露[26]、机动车尾气暴露[69]。

2.6.3其他联合方法 在建模过程中，联合应用中医辨证学可达到更稳定的实验效果[70]。不同联合方案也不断出现，如基因工程技术增加诱导因素敏感性+诱导因素[63-64,71]、CSE+蛋白酶[72]、血管内皮生长因子阻滞剂联合低氧暴露[61]等。采用何种诱导因素联合方案主要取决于实验研究目的，在已明确的单因素诱导机制作用下联合其他因素诱导，以缩短建模时间或构建复杂表型。目前，应用于实验研究的建模方案较多，但仍未构建出完全符合人类COPD所有特征的动物模型。

3 动物模型评价

理想的COPD动物模型应与人类COPD有相似的致病因素及疾病发生发展过程，即呈进行性发展的不完全可逆的气流受限以及气道炎症、气道重塑、肺气肿、氧合功能下降等病理生理改变[21]，并具有切合实验目的且更具有价值及意义的评价方法。崔红新等[73]以肺功能、肺组织形态学、肺泡灌洗液分析、炎症指标等指标评估COPD模型，而多数实验主要采用肺功能、肺组织病理改变、炎症水平进行评价。

3.1行为学分析 在建模过程中，通过观察实验动物的行为学改变进行模型评价，如口鼻腔分泌物增多[70]，活动耐量下降，体重增长缓慢[30]等行为学变化，该法简单、直观，但影响动物行为变化的因素较多，缺少标准评价方法。

3.2肺功能分析 肺功能测定有无创和有创两种方法[74]。有创肺功能测定指在麻醉状态下行气管插管，通过肺功能仪记录动物被动呼吸的气道阻力、肺顺应性及弹性、敏感性和特异性，可直接观察用药前后肺功能改变[75]，由于为非正常生理状态下肺功能测定，且不能纵向多次检测等，较少采用。无创肺功能测定包括体积描记法、脉冲震荡法等[74]，可在生理状态下多次重复测量，被较多采用。常测定的肺功能指标包括气道阻力、肺顺应性、用力肺活量等，其中以气道阻力相关性较大[73]。通常测定0.05、0.1、0.2、0.3 s的用力呼气量，并分析0.3 s用力呼气量/用力肺活量、0.2 s用力呼气量/用力肺活量等参数。

3.3肺组织病理学分析 肺组织病理检测是COPD动物模型最重要的指标，可完成多种检测进行相关分析。钟小宁等[76]观察直径≤1 100 μm(管腔最短径/最长径≥0.7)的膜性细支气管，并通过评分表量化气道炎症水平；应用苏木精-伊红染色测定平均内衬间隔、肺泡破坏指数等，评估肺泡破坏情况[30]；通过Masson染色观察气管厚度等，评估气道重塑[74]；通过AB-PAS染色检测黏多糖分泌情况；应用TdT介导dUTP末端标记技术分析细胞凋亡情况；应用免疫组织化学法进行生物信号通路、自噬等相关分析[30,58]。

3.4炎症水平分析 肺泡灌洗液和血液中的炎症细胞及炎症介质水平也是评价COPD模型的常见指标，通常对准确性更高的肺泡灌洗液中的炎症相关指标进行分析，如白细胞总数、中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、CD4+、CD8+及炎症介质、氧化抗氧化指标、金属蛋白酶/抗金属蛋白酶、趋化因子等[5,9,44,73,77-78]，其中白细胞总数及分类计数较常用且准确性较高[73]。

3.5影像学分析 微型计算机断层扫描的分辨率达纳米级，可无创并长期动态观察肺组织结构变化，并进行定性和定量分析。Kobayashi等[9]应用微型计算机断层扫描检测肺泡平均线性截距、肺体积、炎症表现，并进行肺脏三维重建，可更好地分析肺脏体积改变，其评价参数中以低衰减面积百分比最为敏感。微型计算机断层扫描的空间及时间分辨力高，联合衍射增强成像方法可对早期肺气肿进行评估，发现微观结构改变[61,79]。

3.6其他指标 除上述评价内容外，其他常见指标[61](如血气分析、呼吸肌功能、肺血流动力学)亦可用于COPD模型评价，其中肺脏血流动力学检测可应用于评估COPD模型是否合并肺动脉高压、慢性肺源性心脏病等并发症。

4 小 结

鼠类被普遍用于构建COPD模型，具有基因明确、品系多、研究技术成熟等优势，是较理想的COPD模型实验对象。不同诱导因素具有独特的研究价值，需根据实验目的选择合适的建模方案，并根据模型特点选择相应的检测指标，结合结构、功能、病理生理、细胞、分子水平指标综合考量，使研究具有客观性、准确性、可重复性。随着对空气污染物的重视以及基因改造技术的发展，使用空气污染物诱导构建COPD动物模型逐渐兴起；此外，无创微型计算机断层扫描可长期动态评价肺脏结构改变指标，具有重要应用价值。人类COPD病因、发病机制、病理生理改变复杂，单因素诱导构建COPD模型耗时长、效果欠佳、特征分离，目前常采用的多因素联合诱导建模方法可提高建模效率、构建复杂表型，但仍未能完全模拟人类COPD特征。随着基因改造技术、诱导条件的不断改进以及COPD动物模型的不断发展，终将构造出更切合人类COPD特征的动物模型，以为预防及治疗COPD提供更好的研究平台。