产肠毒素型脆弱拟杆菌促进结直肠癌发生发展的机制研究进展

何秋月，杜艳

(昆明医科大学第一附属医院检验科 云南省检验医学重点实验室 临床检验诊断省创新团队，昆明 650032)

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是常见的消化道恶性肿瘤。在我国，其死亡率居恶性肿瘤死亡率的第五位[1]。长期以来，人们普遍认为饮食(高红肉/低纤维)、肥胖、吸烟、饮酒和遗传是CRC发生发展的重要危险因素[2]。但随着宏基因组技术的应用及肠道菌群研究的兴起，研究者们发现CRC的发生、发展与肠道菌群有密切联系，且认为肠道菌群紊乱是CRC发生的重要危险因素[3-5]。肠道菌群可能通过与宿主免疫系统的直接相互作用，产生与癌症相关的代谢物或释放毒力因子，潜在地促进CRC的发展[6]。与CRC相关的肠道微生物主要有脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis，BF)、大肠埃希菌、解没食子酸链球菌、粪肠球菌和具核梭形杆菌等[7]。其中，BF极具代表性，不同类型的BF菌株在CRC的发生发展和调控防治方面有不同的作用[8-9]。非产肠毒素型脆弱拟杆菌(nontoxigenic bacteroides fragilis，NTBF)因不含脆弱拟杆菌肠毒素(Bacteroides fragilis enterotoxin，BFT)而表现出益生菌活性[8]，产肠毒素型脆弱拟杆菌(enterotoxigenic bacteroides fragilis，ETBF)则可能导致慢性结直肠疾病，包括肠炎症、慢性结直肠功能障碍以及结直肠癌前病变和癌变[10]。越来越多的研究表明，ETBF参与CRC的发生发展[2,4,11-14]，但国内研究相对较少。现就ETBF促进CRC发生发展机制的研究进展予以综述，以期为CRC的早期诊断和防治提供新思路。

1 ETBF的生物学特性和功能

BF是人体胃肠道中数量最少但感染检出率较高的厌氧菌，革兰染色为阴性，有荚膜，无芽孢，部分有菌毛，主要位于结肠[10]。ETBF的致病性由多种因素引起，包括荚膜、外膜蛋白和BFT。BFT是一种分子量约20 000的热不稳定肠毒素，也是联系ETBF与CRC的重要毒力因子。其本质为蛋白水解酶，不耐热，具有较强的生物学活性和毒性，能分泌到菌体细胞外引起组织细胞损伤，对人和动物均有致腹泻和肠炎的作用[10]。目前已发现3种BFT：BTT-1、BFT-2和BFT-3，分别由bft-1、bft-2、bft-3编码。在全球范围内分离出的ETBF中，BTT-1占比最高，BFT-2次之，BFT-3最少[15]。ETBF的基因组包含了一个长约6 kb的致病岛，该致病岛含有控制转录的BFT基因上游的启动子序列。BFT的产生受细菌双组分调节系统(细菌双组分调节系统Rprx/Rpry)调控，细菌双组分调节系统是细菌中将环境刺激与基因调控结合起来的一种常见策略，有研究表明Rprx和Rpry的过表达在体内外均能抑制BFT的产生，其中Rprx作为BFT调控的关键，对ETBF的定植和宿主-ETBF稳态至关重要[16]。虽然NTBF菌株不具有致病岛，但某些存在侧翼区域的菌株允许致病岛从ETBF菌株传递到NTBF菌株，从而使细菌间的致病性得以传播。Bolei等[17]的研究显示，BFT-2是ETBF最常见的黏膜亚型，其相较BFT-1具有更强的效力和生物学活性，并显示出更强的致癌潜力。BFT的生物学功能主要包括：①可能促进结肠生态位的获取和生存，特定的ETBF菌株能以毒素依赖的方式定植先前被NTBF占据的生态位[18]；②可能促进ETBF的传递，BFT的产生和相关腹泻可能通过粪-口途径增加病原菌在人群中的传播[19]；③在肠外感染中可能起重要作用。因此，BFT成为目前研究最多的脆弱拟杆菌毒力因子之一，这种毒素可能是慢性结肠炎和CRC的驱动因素[20-21]。较微量的BFT即可引起结肠癌细胞系HT29细胞的形态学改变、细胞间连接损伤、基因表达差异和表观遗传改变等[10,22]。

2 ETBF与结直肠癌的相关性及可能调控机制

人体肠道中的“驱动力”或“基石”细菌在CRC的发生发展中扮演了重要角色[4]。这些细菌相当于 “Driver-passenger”模型中的Driver，被认为可直接致癌，能够重塑黏膜免疫反应和肠道微生物群落，促进CRC的发生，而ETBF扮演了该模型中的Driver角色[2,23]。研究显示，约90%的CRC患者可检测到ETBF定植，表明ETBF阳性和丰度增加与CRC有重要联系[24]。Haghi等[12]利用neu和bft标记基因的聚合酶链反应直接对CRC患者粪便中的BF以及肠毒素亚型bft-1、bft-2和bft-3进行检测，发现ETBF以及bft基因在CRC中的检出率显著增高，且晚期CRC患者bft基因阳性率明显高于早期患者。此外，Purcell等[23]的研究提出在CRC的癌前病变早期(即腺瘤性结肠息肉阶段)就已经出现了ETBF的高丰度定植，在管状腺瘤、锯齿状病变和低度异型增生的结肠组织中同样检测到了ETBF，并推测ETBF极有可能作为CRC早期诊断的潜在指标。为进一步探索ETBF在CRC发生发展中的具体调控机制，研究者们利用ETBF进行了一系列体外动物实验，发现ETBF能够在体外促进小鼠CRC的发展[25]。目前，ETBF诱导并促进CRC发生发展的可能机制主要包括诱导慢性炎症的发生，促进结肠细胞的增殖等。

2.1诱导慢性炎症的发生 CRC的发生起源于一系列事件，包括致病刺激，如细菌感染，然后为慢性炎症，进而使得细胞微环境发生改变，导致癌前病变，最后癌变[26]。慢性炎症是CRC发生的独立危险因素，炎症细胞衍生的细胞因子直接或间接刺激癌细胞的生长[19-20]。BFT可引起炎症细胞释放活性氧类，促进细胞因子和趋化因子的表达，创造一个有可能加剧活性氧类介导的细胞DNA损伤的环境，因此更有利于肿瘤细胞的生长[14,27]。BFT可通过多条信号通路诱导慢性炎症发生，进而促进CRC的发展。

2.1.1核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信号通路的激活 转录因子NF-κB通过协调天然免疫和获得性免疫功能，在宿主对微生物感染的应答中发挥重要作用[28]。NF-κB蛋白激活而导致的长期慢性炎症可能会导致组织损伤，并通过改变受损组织和宿主微环境的遗传和表观遗传状态进一步促进肿瘤的发生[9]。Chung等[21]构建了一株具有bft基因框内染色体缺失的ETBF菌株并将其定植于腺瘤性结肠息肉(adenomatous polyposis coli，APCmin)小鼠，结果表明ETBF通过刺激细胞内白细胞介素(interleukin，IL)-17分泌，激活NF-κB途径，进而诱导趋化因子(CXC趋化因子配体1、CXC趋化因子配体2和CXC趋化因子配体5)的表达，这些趋化因子共同促进了CRC的发生。BFT也可激活结肠上皮细胞中的NF-κB信号通路，导致结肠上皮细胞基底外侧膜释放促炎趋化因子，如IL-8和肿瘤坏死因子-α。其中，IL-8具有中性粒细胞趋化作用，可招募更多未成熟的多形核细胞，继续加重炎症和细胞损伤[2]。此外，NF-κB信号通路的激活会增加多胺代谢，诱导结肠上皮内的DNA损伤[23]。而Hwang等[29]用NF-κB的抑制剂球姜酮处理ETBF感染的小鼠和HT29/C1结肠上皮细胞发现，小鼠结肠巨噬细胞浸润明显减少，结肠炎症减轻，BFT诱导的NF-κB信号转导和IL-8分泌均显著减少。

2.1.2信号转导及转录激活因子3(signal transduction and activator of transcription 3，STAT3)/辅助性T细胞17(helper T cell 17，Th17细胞)免疫反应的激活 在肠道，炎症触发因素和启动致病性Th17)细胞免疫反应的分子机制一直被作为肠道炎症疾病和结肠肿瘤发生的治疗靶点[30]。有研究显示，ETBF在动物模型中触发了由STAT3/IL-17驱动的慢性结肠炎，并促进了APC基因杂合子小鼠结肠肿瘤的快速形成，这依赖于IL-17的释放，激活Th17细胞炎症反应[2,31]。免疫细胞的募集会释放出遗传毒性的氧自由基，使多种DNA双链断裂，从而导致炎症驱动的致癌[32]。“Driver”病原体(如ETBF)诱导的Th17细胞依赖性炎症可能改变肿瘤微环境，为机会致病菌[某些乘客细菌(具核梭形杆菌属和链球菌属等)]产生新的生态位，在CRC进展过程中胜过“Driver”细菌，这就是著名的 “细菌司机-乘客模型”，乘客细菌逐渐定植于结肠黏膜，导致肠道微生物失调，最终促进CRC进展[23,33]。FoxP3+调节性T细胞(regulatory T cell，Treg细胞)通常抑制炎症反应，并维持肠道免疫平衡。但Geis等[30]研究发现，结肠Treg细胞激活了IL-17介导的多发性肠道肿瘤小鼠(以人类ETBF定植)的致癌作用，同时限制了IL-2在局部微环境中的可获得性，表明Treg细胞对ETBF的反应也可以促进结肠肿瘤的发生。

2.1.3促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路的激活 MAPK信号通路在调节细胞炎性改变和增殖凋亡过程中发挥重要作用[34]。在BFT刺激下，肠上皮细胞分泌IL-8和单核细胞趋化蛋白1能够快速激活MAPK信号通路，激活的MAPK信号通路又通过醛糖还原酶、c-Jun氨基端激酶、IκB激酶和NF-κB通路诱导细胞间黏附分子-1表达，使炎症细胞与内皮细胞的黏附作用增强，导致内皮细胞通透性降低，从而加重炎症细胞的浸润[35]。有研究发现在BFT刺激早期，可通过激活MAPK/环加氧酶2/前列腺素E2/c-IAP2等信号通路来抑制结肠上皮细胞凋亡，从而为上皮细胞提供足够的时间来产生激活黏膜炎症的信号，且增加细菌定植的机会[36]。Jeon等[37]将结肠上皮细胞暴露于BFT中，结果发现BFT能够快速激活p38 MAPK信号通路，进一步激活核因子E2相关因子2，最终诱导Srx-1(Sulfiredoxin-1)的表达增加，而Srx-1表达上调可能抑制细胞凋亡。可见，ETBF可通过激活MAPK信号通路加剧组织炎症反应，抑制细胞凋亡，进而促进CRC的发展。

2.1.4多信号通路级联作用 ETBF诱导的慢性炎症不仅通过单一的炎症通路发挥作用，各通路之间往往也相互调节，协同作用。Chung等[21]将ETBF感染的APCmin小鼠作为微生物诱导的结肠肿瘤发生模型发现，BFT在结肠上皮细胞中触发了IL-17受体、NF-κB和STAT3信号介导的多步致癌的炎症级联反应，这三个信号通路均是ETBF诱导小鼠肿瘤发生所需要的，且均与人类CRC密切相关。即bft诱导从结肠上皮细胞到黏膜Th17细胞反应的致癌前信号转导，导致远端结肠上皮细胞中NF-κB的选择性激活，从而共同触发髓系细胞依赖的远端结肠肿瘤的发生[38-39]。Ko等[36]用纯化的BFT刺激结肠上皮细胞发现，BFT激活了c-Jun氨基端激酶-MAPK/激活蛋白-1/C/EBP同源蛋白-10的信号级联反应，从而抑制了结肠上皮细胞中自噬体与溶酶体融合，表明ETBF可能通过干扰完全自噬进而影响CRC的发展。一项研究表明，ETBF在Toll样受体4-活化T细胞核因子5依赖的途径中上调了含有JmjC结构域的组蛋白去甲基化酶2B水平，在促进CRC发生的肿瘤干细胞调节中发挥重要作用[14]。可见，ETBF可同时激活多条信号通路，促进结肠慢性炎症的发生，影响结肠细胞的凋亡、增殖、自噬、干细胞调节等，进而促进CRC的发生发展。

2.2诱导结直肠细胞的增殖 结直肠细胞的无限增殖在CRC发展过程中尤为重要，而ETBF的定植在结直肠细胞的增殖过程中发挥关键作用，其主要机制为BFT激活了经典的Wnt/β联蛋白(β-catenin)通路[40-41]。β-catenin是Wnt信号通路的第二信使。在未受刺激的细胞中，β-catenin与轴蛋白Axin、APC、角蛋白1α和糖原合成酶激酶3形成大分子复合物，其中酪蛋白激酶1α和糖原合成酶激酶3发生磷酸化使β-catenin在蛋白酶体26S中被泛素化并降解。当细胞受到刺激时，Wnt糖蛋白配体与Frizzed受体和低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(low-density lipoprotein receptor-related protein 5/6，LRP5/6)共受体相互作用使支架蛋白Dvl募集到细胞膜，形成Wnt-Fzd-LRP5/6-Dvl分子复合物，该复合物形成了与Axin蛋白相互作用的结构区域，随后糖原合成酶激酶3使LRP5/6磷酸化，不再磷酸化和泛素化β-catenin。当细胞内β-catenin达到一定水平时则会进入细胞核内，取代CoR与转录因子Lef1/TCF结合，最终实现某个特定基因表达的增强或减弱[40,42]。此外，BFT能与上皮细胞中的上皮钙黏素结合并将其裂解，从而激活Wnt信号通路，使游离的β-catenin从细胞质进入细胞核，与Lef1/TCF结合，激活Wnt通路的下游靶基因，如细胞周期蛋白D1和c-myc等，促进结肠细胞的增殖。同时，c-myc的释放会增加精胺氧化酶的表达，进一步促进结肠细胞损伤和癌变[6]。

2.3形成细菌生物膜 细菌生物膜被认为是CRC发生的初始阶段，即从宿主腺瘤向宿主癌恶性转化之前的独立驱动因素[43]。ETBF能够单独或与其他致病菌共同形成生物膜，生物膜中的ETBF可能是一种扩散屏障，能导致抗生素进入受限并使菌体本身在恶劣环境中生存，从而促进CRC的发展[44]。此外，生物膜中细菌-细菌和宿主-细菌之间的相互作用也可能影响肠道上皮的代谢，导致细胞过度增殖，进而促进CRC的发生和发展。Jasemi等[13]从CRC患者活检组织中分离BF，并对分离菌株进行鉴定和生物膜形成检测发现，ETBF菌株检出率较高，且较NTBF菌株更容易形成生物膜。因此推测，BFT基因的存在可能与脆弱拟杆菌的生物膜形成能力和CRC的发生相关。Tomkovich等[45]用从CRC标本中分离的多菌生物膜接种APCminIL-10-/-小鼠诱发肿瘤，结果发现BFT+多菌生物膜较BFT-样品更容易在小鼠远端结肠诱导炎症。家族性腺瘤性息肉病(familial adenomatous polyposis，FAP)是一种常染色体显性遗传性疾病，属于结直肠癌前疾病。Dejea等[20]在FAP患者结肠组织中发现了大量ETBF和携带PKS基因岛的大肠埃希菌共存的生物膜，进一步动物实验表明在共同定植两种细菌的偶氮甲烷诱导小鼠中，肿瘤致死率明显增加。Drewes等[46]观察到直肠癌患者活检组织中富含ETBF和具核梭形杆菌的多菌生物膜，且结肠右侧多于左侧。此外，多菌生物膜也会增加多胺代谢产物的释放，这可能会加剧CRC的生长、侵袭和转移。可见，ETBF生物膜的形成与CRC的发生发展高度相关，其形成促进了细菌与结肠细胞的相互作用，通过直接或间接的方式激活不同炎症通路，进一步加剧CRC的发展，但ETBF生物膜形成对CRC的具体促进机制仍有待进一步研究。

2.4肠道细菌间相互作用 肠道微生态是一个复杂的系统，肠道菌、代谢物、肠道组织之间相互作用，错综复杂[47]。既要考虑单一细菌的作用，也不能忽视细菌与其他细菌、代谢物、组织器官之间的联系。目前大部分关于ETBF致病性机制的研究仅针对单一菌株，很少研究ETBF与其他物质的相互作用。研究表明，超过50%的FAP患者被ETBF和携带PSK基因岛的大肠埃希菌共同定植[20]，这使得协同致癌作用成为可能。两种细菌的相互作用促进了结直肠肿瘤 CRC的发生，其可能机制为ETBF降解结肠黏液，使携带PKS基因岛的大肠埃希菌黏附性增加，从而诱导结肠上皮细胞DNA损伤。同时，携带PKS基因岛的大肠埃希菌共定植在早期也增强ETBF对IL-17的诱导作用[20]。此外有研究显示，ETBF能分泌活性岩藻糖苷酶，在黏蛋白存在的情况下，能够促进空肠弯曲杆菌对结肠癌细胞Caco-2的侵袭性[48]。相反，益生菌酪酸梭菌NCTC7423的上清代谢物则可显著下调ETBF毒力相关基因OmpA和bmeB3的表达，抑制ETBF生长和生物膜形成[49]。这表明，ETBF与其他肠道微生物的协同或抑制作用在CRC的演变过程中起重要作用。

3 小 结

肠道微生物在CRC的发生发展过程中尤为重要，ETBF是其中一个比较有特征的细菌，其可能通过诱导慢性炎症、促进细胞增殖、形成多菌生物膜以及与细菌和宿主的相互作用等途径促进CRC的发生发展。但目前对BF的研究处于初级阶段，对ETBF的研究仍面临着很多问题，其促进CRC的发展机制有待进一步研究。今后可以建立ETBF携带与疾病特定表现之间的功能性关联，进一步研究ETBF在CRC中的作用机制，以确定ETBF是否可以作为当前CRC筛查的辅助手段。此外在CRC发展的早期，如腺瘤性息肉阶段或炎性肠病阶段，ETBF已经表现出丰度增高以及促进作用，可以此为着力点，探索腺瘤癌变序列的具体微生物机制，也可利用NTBF作为下一代益生菌的特点，结合转基因技术，引入抗炎性相关分子，以发展新的CRC个性化预防策略。