三阴性乳腺癌的表观遗传学研究进展

张凌燕，阮祥燕

(首都医科大学附属北京妇产医院内分泌科，北京100026)

乳腺癌是全球范围内女性患病率最高的恶性肿瘤，也是我国女性癌症死亡的最常见原因[1]。Perou等[2]分析了包含8 102个基因的互补DNA芯片，通过检测雌激素受体、孕激素受体和表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，HER)2的表达，发现了乳腺癌的4个分子亚型，并用于分层靶向治疗。三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)是一类基于分子分型的特殊类型乳腺癌，2005年首次对TNBC进行了描述[3]。由于TNBC缺乏雌激素受体、孕激素受体和HER2，因此无法接受激素或抗HER2药物治疗。TNBC具有特殊的生物学表达和临床病理特性，其病理特点包括高分级、浸润性扩散以及高有丝分裂率，表现为高级别的浸润性导管癌及区域性坏死，TNBC的局部复发率和远处转移率均高于其他类型乳腺癌[4]。有证据表明，表观遗传调控可能在乳腺癌的发展中发挥重要作用，有助于乳腺癌的异质性和转移，尤其是TNBC[5]。表观遗传学研究是在不改变DNA序列的情况下研究基因表达的可遗传变化，而表观遗传学是T细胞分化的关键机制[6]。Schoenborn等[7]证明，辅助性T细胞1和辅助性T细胞2是不同的谱系，而不是细胞因子表型移位。最早记录的表观遗传学修饰是DNA甲基化和组蛋白修饰[8]，其他还包括非编码RNA和染色质重构。现就TNBC的表观遗传学研究进展予以综述。

1 DNA甲基化与TNBC

DNA甲基化是细胞进化的先决条件，也是许多病理机制发生的根源。DNA甲基转移酶(DNA methylation transferases，DNMTs)主要在选定基因启动子的CpG二核苷酸环境中催化胞嘧啶-C5的甲基化，其中DNMT1负责复制后甲基化模式的维持，DNMT3a和DNMT3b启动从头甲基化[9]。通过DNA甲基化分析检测乳腺癌的灵敏度是利用细胞学检测乳腺癌的2倍，将DNA甲基化分析与细胞学检测相结合，检测乳腺癌的准确度可达100%[10]。有研究通过分析69个癌症相关基因中110个CpG岛的高甲基化发现，TNBC中含有5个基因的甲基化和11个基因的非甲基化，其中甲基化DNA-蛋白质半胱氨酸甲基转移酶、复制后DNA错配修复系统、DNA结合蛋白抑制剂ID-4与TNBC的相关性最强[11]。最全面的TNBC甲基化分析可以根据不同甲基化区域将患者样本分层为三个不同水平，TNBC甲基化程度与预后相关[12]。与高甲基化组相比，低甲基化组患者在诊断后的前5年生存率更高，而中甲基化组患者的生存率最低；同时，最全面的TNBC甲基化分析鉴定出17个独立的不同甲基化区域，根据这些不同的甲基化区域可将TNBC患者分为预后良好和预后不良组；其中甲基化区域包括Wilms肿瘤蛋白基因及Wilms肿瘤蛋白反义基因，Wilms肿瘤蛋白及其反义基因高水平的甲基化与TNBC生存率低相关；双向启动子的高甲基化与Wilms肿瘤蛋白及Wilms肿瘤蛋白反义基因表达减少、存活率提高有关[13]。然而，这些发现仍有待更大的队列研究证实。

约30%的TNBC患者具有乳腺癌基因(breast cancer gene，BRCA)1突变，且通常预后较差[14]。10%～20%的TNBC患者存在种系BRCA突变，在野生型BRCA患者中，同源重组的体细胞突变也能产生类似的突变表型，这种状态被称为BRCAness[12]。同源重组的体细胞突变可能是由BRCA1基因启动子区域的高甲基化导致[14]。癌症基因组图谱网络描述了基底细胞型乳腺癌的低甲基化表型，该亚型的DNA甲基化程度最低，且与80%的细胞瘤抗原p53突变相关，且常与视网膜母细胞瘤相关蛋白和BRCA的缺失相关[15]。在TNBC与非TNBC中，BRCA1和BRCA2启动子的甲基化无显著差异，而非甲基化基因DNA结合蛋白抑制剂ID-4是BRCA1的负调控因子[16]，这可能成为一种新的BRCA沉默机制。

乳腺癌干细胞(breast cancer stem cells，BCSCs)是TNBC侵袭性的重要驱动因素，通过研究启动子甲基化对BCSCs的调控，可阐明DNA甲基化在TNBC中的作用。研究发现，与BCSCs特性相关的CD44、CD133和Musashi-1启动子区域在原发性乳腺癌中被低甲基化，与TNBC及侵袭性乳腺癌相关[17]。Li等[18]从MDA-MB-231细胞培养中筛选出CD44+/CD24 BCSCs群，结果发现，BCSCs与非BCSCs的DNA及组蛋白甲基化均存在差异，特别是组蛋白3第4位赖氨酸的二甲基化(trimethylation of lysine 4 on histone H3，H3K4me2)和组蛋白3第27位赖氨酸的三甲基化(trimethylation of lysine 27 on histone 3，H3K27me3)在BCSCs中均减少，而H3K4me2、H3K27me3减少可能影响Wnt和促性腺激素释放激素信号通路。虽然BCSCs在体内和体外均表现出更强的侵袭性和致瘤能力，但具体机制仍有待阐明。

2 组蛋白修饰与TNBC

组蛋白修饰是组蛋白翻译后的共价键改变，可以激活或沉默基因表达，影响染色质结构和基因转录，是重要的表观遗传学标志。组蛋白修饰包括甲基化、磷酸化、乙酰化、泛素化和苏酰化等。H3K4me1、H3K4me3、H3K9me3、H3K9ac、H3K27me3、H3K27ac、H3K36me3、H3K79me2八种关键性组蛋白修饰已在13个细胞系中被证实，其中的4个细胞系为TNBC MDA-MB-231、MDA-MB-436、MDA-MB-468和HCC1937[5]。一些组蛋白N端修饰与基因启动子区的激活或沉默有关，组蛋白H3在赖氨酸残基9和27(H3K9me3、H3K27me3)被多梳抑制复合物2甲基化是沉默染色质的标志，赖氨酸乙酰化(H3K9ac、H3K18ac、H4K12ac)、赖氨酸三甲基化(H3K4me3)、精氨酸二甲基化(H4R3me2)等特异性修饰是基因活化的标志，而赖氨酸甲基化(H3K9me2或H3K9me3和H4K20me3)通常与基因沉默有关[19]。

虽然TNBC的组蛋白修饰机制尚不完全清楚，但基于此理论基础的治疗已在临床前研究中取得了一定进展。表观遗传疗法是基于组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)和组蛋白乙酰转移酶的理论基础。HDAC从组蛋白中去除乙酰基，调控细胞凋亡及相关分化蛋白，进而调节基因表达的稳定性；同时，通过调控肿瘤抑制因子，诱导生长阻滞和分化[19]。HDAC抑制剂目前正在实体和血液恶性肿瘤中进行研究，可多途径抑制肿瘤生长，如通过抑制血管内皮生长因子-D的表达，对抗淋巴管生成，抑制TNBC的淋巴转移；通过增加周期蛋白依赖性激酶抑制因子的表达，减少细胞周期蛋白的含量，进而将肿瘤细胞阻滞于G1期或G2期，从而阻止肿瘤细胞的增殖或生长，诱导细胞凋亡[20]。研究表明，HDAC抑制剂亚磺酰苯胺异羟肟酸和丁酸钠均可抑制TNBC细胞系MDA-MB-231和BT-549中p53突变体的细胞增殖、诱导细胞凋亡并下调转录[21]。奥拉帕尼和HDAC抑制剂(NCT023794、NCT01349959)联合应用可协同抑制表达功能性人类第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因的TNBC细胞的生长，且奥拉帕尼与HDAC抑制剂的联合作用在异体移植模型中已得到证实[22]，具有广阔的临床应用前景。

3 非编码RNAs与TNBC

大数据转录分析表明，在约80%的人类基因组中只有约2%编码蛋白质[17]。因此，绝大多数哺乳动物转录组包含的非编码RNAs在各种基因表达调节和其他生物学过程作用中起重要作用。根据非编码RNAs的大小、结构和调节特性其可分为两类，即长度>200个核苷酸的长链非编码RNAs(long non-coding RNAs，lncRNAs)和长度<200个核苷酸的短链非编码RNAs，其中短链非编码RNAs又包括微RNA(microRNAs，miRNAs)、小核仁RNAs和Piwi蛋白相互作用RNAs[23]。miRNAs由于在肿瘤的生物发生、转移及治疗等领域均具有重要意义而被广泛研究，而lncRNAs已成为发育过程(包括乳腺发育)的关键调控因子，lncRNAs失调与包括乳腺癌在内的各种癌症的发生有关。

3.1lncRNAs与TNBC 对TNBC患者的微阵列分析研究发现，与正常组织相比，许多lncRNAs的表达模式不同[24]，但lncRNAs的具体功能、作用途径及重要意义还有待进一步阐明。有研究报道了4个不同的lncRNAs集簇，第一个集簇几乎完全由基底样亚型组成，其中HOTAIR M1(HOXA transcript antisense RNA，myeloid-specific 1)在该簇中过表达[25]，但HOTAIR M1的作用仍有待确定。另一个有前景的lncRNAs靶点为Fox-1同源物1基因启动子上游转录体，Fox-1同源物1可能是一种负责基底样肿瘤侵袭性表型的促癌基因[26]。HOTAIR是一种通过H3K27甲基化与乳腺癌侵袭性进展相关的lncRNAs，HOTAIR在MCF-7-TNR细胞中上调，MCF-7-TNR细胞是管腔型MCF-7细胞的基底样衍生物；另外，HOTAIR与其伴侣zeste同源物2形成复合物，在基底样TNBC表型中发挥关键作用，当HOTAIR或zeste同源物2受到抑制时，管腔型及基底样标志物的表达均减少，MCF-7-TNR细胞的增殖受到抑制[27]。

一项关于TNBC患者组织样本中lncRNAs的微阵列图谱研究发现，TNBC中雌激素受体的功能失调可能与lncRNAs LINC00993有关[28]。研究表明，lncRNAs肺腺癌转移相关转录物1与TNBC的转移潜能相关，并可作为TNBC的潜在预后标志物[29]。Liu等[30]通过整合miRNAs和lncRNAs信息，创新性地将TNBC分为四类，即免疫调节型、腔面雄激素受体型、间质型和底样及免疫抑制型。这种分型方法与Lehmann和Pietenpol[31]的分型部分相同，其中免疫抑制型侵袭性最强。有文献报道，在乳腺癌和其他癌症的lncRNAs中，低甲基化发生率更高，lncRNAs EpIC1(epigenetically-induced lncRNA1)的低甲基化可上调肿瘤细胞的表达，而EpIC1过表达与患者的不良生存结局独立相关，特别是基底样亚型B乳腺癌，基底样亚型B乳腺癌通过与MYC直接作用增加MYC靶基因的表达、促进细胞周期进程等，促进肿瘤生成[32]。

3.2miRNAs与TNBC miRNAs在肿瘤中有两种作用形式，分别发挥抑制和促进肿瘤发生的作用，抑制肿瘤的miRNAs包括miR-200家族、miR-205家族和let-7家族等，促进肿瘤的miRNAs包括miR-155及miR-21等，因此miRNAs也是潜在的TNBC生物标志物。研究发现，miR-10b、miR-26a、miR-146a和miR-153在乳腺癌细胞系中的表达水平与BRCA1相关，在MDA-MB-231细胞中，BRCA1的表达水平被miR-10b和miR-26a下调，miR-146a在TNBC中显著过表达但并不影响BRCA1的表达，而miR-153可以上调MDA-MB-231细胞中BRCA1的表达[33]。然而，Kumaraswamy等[34]的研究显示，BRCA1的表达与miR-146a呈正相关，与HER2呈负相关。此外，Garcia等[35]报道，miR-146a和miR-146b-5p可下调TNBC中BRCA1的表达。Murria等[36]研究发现，miR-590-5p和miR-4417在TNBC中高表达，miR-590可以通过与雌激素受体的两个信使RNA序列相互作用影响雌激素受体调控，而miR-4417可以调控BRCA1信使RNA。Gasparini等[37]在TNBC中发现了一个miRNAs组合，可以将患者分为高危组和低危组，其中miR-493和miR-155上调与患者预后良好相关，而miR-30a和miR-27a下调与患者预后不良相关。

另外，miRNAs也是上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的驱动因子，这是启动TNBC转移的一个重要过程。miR-200家族通过靶向EMT过程中的两个关键基因[锌指E盒结合同源框(zinc finger E-box-binding homeobox，ZEB)1和ZEB2]逆向调控肿瘤的EMT过程[37]。miR-200c、miR-141位点甲基化与TNBC中miR-200c的低表达及淋巴结浸润有关，有利于脑转移，进而影响TNBC患者的预后[38]。在小鼠乳腺癌异体移植模型中，miR-200b通过抑制蛋白激酶Cα抑制TNBC转移；miR-200a还可通过调控磷酸化上皮细胞激酶2基因的表达调节TNBC迁移；而miR-200b-3p和miR-429-5p过表达通过抑制LIM激酶1/丝切蛋白1通路抑制TNBC细胞的增殖、迁移和侵袭[39]，为TNBC的靶向治疗开辟了新视野。

近年，有学者将血液中的外泌体miRNAs作为诊断和评估癌症患者预后的新型标志物[40]。外泌体含有大量的分子，如细胞类型特异性蛋白、脂质、信使RNA和丰富的miRNAs等。Meng等[40]发现，与非转移性乳腺癌细胞和正常乳腺癌细胞相比，转移性乳腺癌细胞中的外泌体miRNAs水平更高，其中miR-10a、miR-10b、miR-21、miR-27a、miR-155、miR-373均显著上调；在小鼠模型中，MCF-10A细胞经MDA-MB-231细胞外泌体或乳腺癌患者来源外泌体处理后导致肿瘤发生[37]。Wei等[41]报道，MCF-7来源的外泌体可以呈剂量依赖性地促进宿主细胞增殖，外泌体miR-128特异性地通过靶向Bax基因增强MCF-7细胞的增殖。Wang等[42]发现，与非侵袭性MCF-7细胞释放的外泌体相比，高侵袭性MDA-MB-231细胞释放的外泌体可以刺激受体细胞产生更强的运动能力。

4 染色质重构与TNBC

染色质重构是指通过修饰染色质结构调控基因表达允许或限制转录，其可以通过对组蛋白或非编码RNAs的转录后修饰以及对多梳抑制复合物2的招募或通过ATP依赖的染色质重构蛋白复合体来实现。SWI(mating-type switching)/SNF(sucrose fermentation)是与染色体重构相关的最常见的复合体之一。SWI/SNF的两种ATP酶BRG1(brahma-related gene 1)和BRM(brahma)在乳腺癌中的水平均升高，其中BRG1在TNBC细胞系中的下调导致体内肿瘤形成减少，体外细胞增殖减少，而敲除BRG1导致TNBC细胞株对阿霉素、5-氟尿嘧啶、吉西他滨、顺铂、环磷酰胺和紫杉醇的灵敏度增加[43]。

此外，有研究发现了亚型特异性组蛋白修饰谱，包括TNBC细胞系中独特的H3K36me3模式[44]。另一个特异性TNBC染色质状态是肌动蛋白纤维相关蛋白1-反义RNA1，其标记为H3K4me3和H3K79me2的活性修饰。有报道显示，肌动蛋白纤维相关蛋白1-反义RNA1与TNBC无关，但其在食管腺癌、胰腺导管腺癌、肺癌、鼻咽癌、肝癌、结直肠癌等其他癌症中高表达并预示预后不良；同时，肌动蛋白纤维相关蛋白1-反义RNA1也可能通过EMT促进肿瘤的侵袭[6]。在MDA-MB-231和HCC1937细胞中，小干扰RNA介导的肌动蛋白纤维相关蛋白1-反义RNA1缺失可导致细胞增殖和集落形成减少[44]。

5 小 结

TNBC因具有独特的临床病理和分子特征而备受关注。目前，化疗仍是TNBC患者唯一有效的治疗方法。由于TNBC患者表现出不同的治疗反应和预后，TNBC患者的个体化治疗和预后分析较困难，尤其是当TNBC患者的诊治取决于常规的临床和病理特征(包括组织学分级、原发肿瘤大小、淋巴结转移以及雌激素受体/孕激素受体/HER2表达)时。分子分型破译了不同亚型TNBC的特征，是实现靶向治疗目的和(或)分层的必要前提。随着靶向治疗的出现，筛选更可靠的分子标志物迫在眉睫，而全面了解调控肿瘤生长的表观遗传学，有助于建立准确的TNBC分子分型和有效的治疗方案。