丁酸梭菌介导TLRs/NLRs信号通路调控仔猪肠道损伤分子机制的研究进展

李玉鹏， 李海花， 尚智援， 窦彩霞， 梁世岳， 席燕燕， 乔家运

（1.天津市农业科学院畜牧兽医研究所，天津西青300381；2.天津农学院动物科学与动物医学学院，天津西青300384；3.天津师范大学生命科学学院，天津西青300387；4.河南省农业科学院畜牧兽医研究所，河南郑州450002）

小肠在吸收营养物质的同时，也起到屏障的作用，第一线抵御进入体内的内源性和外源性有害物质（Judkins等，2020；Liu等，2012）。然而，许多因素，如生理变化的感染，可导致肠黏膜损伤和功能障碍。断奶是仔猪繁殖过程很重要的一个过渡阶段，与猪的组织学和生物化学变化有关（Qiao等，2015），这些生理应激反应可增加肠上皮通透性（胡玥和吕宾，2017；Yang等，2015），有助于肠毒素大肠杆菌（ETEC K88）和内毒素脂多糖进入黏膜组织或从肠道转移到机体循环系统，致使机体全身产生炎症反应（Bischoff等，2014），过度的炎症反应会损害肠上皮功能及其完整性（Liu等，2012）。Toll样受体（TLRs）属于模式识别受体，TLR2和TLR4是Toll样受体的2个受体，分布在细胞膜上，参与机体免疫应答（李海花等，2019）。NOD样受体是先天性免疫中的一大类模式识别受体（PAMPs），其中NLRP3、NLRP6和NLRP12作为肠道炎症的负反馈因子在小肠中高度表达，且在维持黏膜屏障功能和微生物的共生平衡中发挥重要的作用（林巧卫等，2019；Chen，2014）。

1 丁酸梭菌的特征、营养作用及应用

1.1 丁酸梭菌的特征 丁酸梭菌（Clostridium butyricum），又称宫入菌、酪酸梭菌，细菌学分类属于梭菌属，是一种严格厌氧革兰氏阳性芽孢杆菌（Wu等，2017）。丁酸梭菌是人和动物肠道的正常菌群，广泛存在于土壤和酸奶中。丁酸梭菌能够产生芽孢，具有抵抗外界相对恶劣环境的理化性质，耐高温，90℃热处理10 min不会失活，在体内能耐受胃液、胆汁酸和消化酶的作用，丁酸梭菌只对少量抗生素新生霉素、万古霉素和四环素等敏感，对其他抗生素具有很强的耐药性，已经成为新一代芽孢益生菌。

1.2 丁酸梭菌的营养作用 丁酸梭菌产生的氨基酸、B族维生素和维生素K，能促进维生素E的吸收，补充机体必要的营养物质 （Storari等，2016）。丁酸梭菌还可以分泌一些酶类，如淀粉酶、糖苷酶、纤维素酶、蛋白酶、果胶酶等，在这些酶的作用下，底物发酵成葡萄糖、麦芽糖等，有助于机体营养物质的消化吸收（Duan等，2017）。此外，丁酸梭菌可以降解益生元产生乙酸、丙酸和丁酸等短链脂肪酸，能够在胃肠道中被机体直接吸收（Shang等，2016）。

1.3 丁酸梭菌在畜禽饲粮中的应用 目前在韩国，丁酸梭菌制剂已经作为饲料添加剂被应用于牛、猪和家禽饲粮中。我国农业部虽然在2009年7月批准丁酸梭菌制剂可以作为微生物饲料添加剂使用，但是至今其在动物饲料中还未被普遍应用。我国市面上销售的微生态制剂产品中，以乳酸菌、芽孢杆菌和酵母菌为主，而丁酸梭菌的产量却较少。饲粮中添加丁酸梭菌和枯草芽孢杆菌配伍的复合益生菌可以提高生长肥育猪的平均日增重、降低料肉比，并提高养分表观消化率（Lan等，2017）。丁酸梭菌既能单独作为饲料添加剂使用，也能与乳酸菌、芽孢杆菌和双歧杆菌等益生菌复配使用，增强该类产品的功效。一株具有产抗菌肽能力的丁酸梭菌饲喂断奶仔猪后，能够替代抗生素、达到高剂量氧化锌的使用效果（王腾浩，2015）。在肉鸡饲粮中添加丁酸梭菌，也可显著提高其体重和平均日增重（Zhang等，2016）。李玉鹏等（2017）研究发现，丁酸梭菌饲喂仔猪，能够提高仔猪的平均日增重，但是对料肉比的影响并不显著。

2 丁酸梭菌对仔猪肠道功能的调节作用

2.1 丁酸梭菌调节肠道微生物区系 黏附是细菌对细胞产生作用的重要步骤，益生菌能够抑制致病菌的黏附来降低其增殖，限制其对宿主的侵害，发挥益生菌的抑菌功能（Scalfaro等，2017）。丁酸梭菌通过产生酸性物质、抗菌物质和致病菌竞争黏附位点等多种作用机制改善肠道菌群（李杨，2018）。脂磷壁酸在细菌黏附过程中发挥重要作用，研究表明，丁酸梭菌脂磷壁酸成分，能抑制拜氏梭菌和大肠杆菌对人结肠癌细胞以及肠道细胞的黏附（Gao等，2011）。杨华等 （2019）研究表明，与产肠毒素大肠杆菌（ETEC）组相比，不同浓度丁酸梭菌干预后，显著抑制了ETEC产黏附基因FaeG与肠毒素基因estA、estB的表达。李玉鹏等（2017）研究发现，丁酸梭菌饲喂断奶仔猪后，可降低空肠和回肠中大肠杆菌的数量，提高空肠和回肠中乳酸杆菌数量，调节肠道微生物区系。

2.2 丁酸梭菌调节肠道紧密连接蛋白 肠道黏膜直接接触外界，其屏障功能的正常发挥直接决定着肠道健康。肠上皮细胞间紧密连接形成的屏障由绒毛与隐窝构成，有利于机体营养物质的吸收和防御功能的正常发挥 （Zhang等，2016）。紧密连接位于肠上皮的顶端，是肠上皮细胞间最重要的连接方式，在维持肠上皮细胞极性和调节肠黏膜屏障通透性中发挥重要作用，是参与控制细胞旁渗透的关键分子。紧密连接由多个蛋白组成，其中闭锁蛋白（Occludin）、闭合蛋白（Claudins）和闭合小环蛋白（ZO）是最为重要的紧密连接蛋白（Jin等，2020）。Zhang等（2016）报道，丁酸梭菌饲喂肉鸡后，可以增加空肠绒毛高度，降低空肠隐窝深度，降低血清中内毒素和二胺氧化酶浓度，提高肉鸡肠道屏障功能。深入研究发现，丁酸梭菌增加肠上皮微绒毛长度、降低跨膜通透性的功能与miR-200c蛋白有关（Xiao等，2017）。研究发现，丁酸梭菌饲喂断奶仔猪后，增加了仔猪肠道紧密连接蛋白Claudin-1、ZO-2的mRNA表 达 （李 玉 鹏 等，2017），降低了血清中二胺氧化酶活性和D-乳酸浓度，提高了仔猪的肠道屏障功能（李海花等，2019）。

2.3 丁酸梭菌调节肠道模式识别受体Toll样受体（TLRs）和NOD样受体（NLRs）广泛存在于肠黏膜上皮中，能够识别多种病原体（细菌、病毒、真菌等）和机体危险信号（Elena等，2017；Song-Zhao等，2014；Zambetti等，2014），激活免疫信号转导，通过NF-κB和MAPK等信号通路启动促炎性细胞因子IL-8和TNF-α等的表达（Song-Zhao等，2014；Zambetti等，2014）。模式识别受体如核苷酸结合寡聚化结构域NOD样受体（NLRs）是肠上皮先天免疫的重要调节因子，NLRs家族成员中 的NLRP3、NLRP6和NLRP12等可参与细胞浆内炎性体的组装，通过半胱氨酸蛋白水解酶-1（Caspase-1）等信号通路促进白细胞介素1（IL-1）家族细胞因子IL-1β、IL-18和IL-33的成熟和分泌（Ruiz等，2017）。适量的促炎性细胞因子能够促进肠组织损伤部位炎性细胞的趋化和浸润，有利于免疫细胞产生抗炎性细胞因子、一氧化氮和抗菌肽等抗感染物质，吞噬和清除病原微生物，促进肠组织再生，保护肠黏膜组织；反之，则可以持续地损伤肠细胞和组织，促使肠道组织异常重构，最终导致肠道通透性增加，肠道屏障功能受损。

2.3.1 Toll样受体（TLRs）TLRs相关的信号通路根据髓样分化蛋白88（MyD88）分为MyD88依赖性和非依赖性两种，这两种通路最终都会激活核转录因子（NF-κB）蛋白的表达。TLR-4及其信号传导途径上的相关分子髓样分化蛋白-2（MD-2）、MyD88和NF-κB是细菌脂多糖（LPS）刺激传导的一种跨膜信号传导通路，在介导革兰氏阴性菌感染的宿主反应中发挥着关键作用（Haghjooy-Javanmard等，2018）。体外试验表明，丁酸梭菌脂磷壁酸能够识别并激活肠上皮细胞中的TLR2，通过髓样分化因子88的非依赖途径，促进适量IL-6和TNF-α的分泌（Gao等，2012）。单核巨噬细胞 （MMs）、树突细胞（DCs）等可以通过其膜表面表达的TLRs感受入侵病原体的PAMPs刺激后，通过胞内信号传导途径，最终由进入胞核内的NF-κB启动核内相关基因表达，产生相应的mRNA，从而合成细胞因子，如IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α及IFN-γ，最终释放到胞外（Yang等，2015），引起粒细胞、巨噬细胞趋化聚集，毛细血管通透性的增加，淋巴细胞浸润等炎症反应，发挥早期免疫应答的效应。丁酸梭菌可以借助细胞壁及裂解后的菌体成分与相应的受体结合，引起固有免疫反应。有研究发现，丁酸梭菌磷壁酸可引起HT-29细胞的炎症反应，但同时也增加了炎症抑制因子的分泌，从而避免由炎性因子的过度表达引起的细胞损伤（Wang等，2016）。在小鼠结肠炎相关癌症模型中，丁酸梭菌miR-200c蛋白调节促炎性细胞因子TNF-α和IL-12的表达（Xiao等，2017）。用丁酸梭菌饲喂太平洋白虾后，能够提高其肠道中Toll样受体、热休克蛋白70和一氧化氮的表达（Duan等，2017）。王柳懿等（2017）研究发现，丁酸梭菌提高了断奶仔猪肠黏膜中TLR2、TLR4和TLR5的表达水平，促进了IL-10、IL-8和TNF-α的分泌，激活了仔猪肠道黏膜免疫反应。这些研究目前还仅停留在模式识别受体和细胞因子的变化方面，而有关丁酸梭菌对仔猪TLRs信号通路影响的研究尚不系统，仍然需要深入研究。

2.3.2 NOD样受体（NLRs）NLRs是仔 猪先天免疫系统的重要组成部分，充当细胞内受体，检测病原体和组织损伤引起的内因性分子加工，其中的NLRP3、NLRP6和NLRP12作为肠道炎症的负反馈因子在小肠中高度表达，且在维持黏膜屏障功能、炎症稳态和微生物的共生平衡中发挥重要的作用（林巧卫等，2019；李玉鹏等，2017；Chen等，2014）。Li等（2018）研究表明，在致病性大肠杆菌攻毒的试验仔猪饲粮中补充丁酸梭菌，能保护肠道的完整性，且通过抑制非鳞状细胞独立性，降低肠道NLRP3信号通路中相关促炎性细胞因子的表达。NLRP6缺陷小鼠与野生型小鼠相比，致病菌可以穿透小鼠更深的上皮隐窝，加重肠上皮损伤 （Wlodarska等，2014）。NLRP12缺陷型小鼠感染减毒疫苗株鼠疫菌后，血清中IL-1β和IL-18减少，脾脏细菌载量增加，小鼠死亡率也增加 （Vladimer等，2012）。由此可见，NLRPs在维持肠道菌群平衡、促进肠黏膜修复、提高肠道屏障和黏膜免疫功能中发挥着重要作用。目前，关于益生菌调节仔猪肠道NLRPs方面研究的报道非常少。Wu等（2016）用鼠李糖乳杆菌处理原代牛乳腺上皮细胞后，发现该菌能够致弱致病性大肠杆菌诱导的NLRP3炎性体的活化，降低IL-1β和IL-18的mRNA表达，减轻了细胞损伤。Li等（2018）研究发现，用丁酸梭菌饲喂断奶仔猪能够提高肠黏膜NLRP3和NLRP6的mRNA表达水平，同时抑制ETEC K88诱导的NLRP3及其下游信号通路Caspase-1等相关基因的表达。由此表明，这些分子在维持宿主-病原体相互作用和炎症反应中发挥着重要作用。但是，有关丁酸梭菌对NLRPs信号通路影响的研究还鲜见更深入、更系统的报道，仍然需要继续深入研究。

3 存在的问题

尽管目前在丁酸梭菌的特征、营养作用及畜禽饲粮中的应用效果等方面已经开展过较深入的研究，但是仍存在一些问题有待解决：（1）丁酸梭菌调节肠道屏障方面的研究仍较少；（2）丁酸梭菌调节肠道黏膜免疫通路方面的研究尚不系统；（3）对丁酸梭菌调节致病性大肠杆菌等有害菌感染仔猪肠道损伤的分子机制认识不透彻等。