猪精液常温保存稀释粉研究进展

贺巾津，牛统娟，李 宇，张利坤，冯天雨，张 星，张 眉，胡建宏*

(1. 西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100;2. 陕西省畜牧技术推广总站，陕西 西安 710016)

猪肉在所有肉类消费品中占有非常大的比重，是美食制作及生活中不可或缺的肉类食材，随着社会的发展人们生活质量得到了不断的提升，猪肉的消费量也逐渐增加。2017年我国生猪的存栏量占世界生猪存栏量的56.56%，生猪出栏量占比54.45%，猪肉产量占比48.09%；2017年世界猪肉消费量11058×104t，我国猪肉消费量5481×104t，占世界猪肉消费量的49.6%[1]。

人工授精作为现代化养猪生产的重要技术手段，在生猪生产和繁殖中有非常必要和十分突出的作用，是生猪生产的重要保障。当前，人工授精技术在国内已经普及，在我国大约有80%～90%的大型养殖场使用人工授精技术，50%～60%的小型养殖场也在使用人工授精技术[2]。在生产中使用人工授精技术可以减少种公猪的存栏量、减少疾病的传播和不受时间地点限制来利用优良基因，从而降低生产成本，提高经济效益。猪精液的保存方法按保存温度不同分为三种，常温保存(17～25 ℃)、低温保存(0～5 ℃)、冷冻保存(-196～-79 ℃)。由于人工授精应用猪冷冻精液会导致母猪受胎率和产仔数降低，在实际生产中主要采用猪精液常温保存技术。猪精液常温保存技术的发展使猪精液常温保存稀释粉应运而生。

猪精液常温保存稀释粉用于配置稀释液，为精子提供一个适宜其生存并能保存其受精能力、适当pH和渗透压的环境，保证精子在体外能够存活较长时间并且结构完整[3]。虽然不同产品之间配方不同，但其成分基本类似，一般包括营养物质、缓冲剂、抗氧化剂、抗菌剂及其他保护成分。本文综述了猪精液常温保存稀释粉中营养物质、缓冲剂、抗菌剂、抗氧化剂、无机盐离子及其他保护成分的研究进展，目的在于为今后猪精液常温保存稀释粉配方的研发提供理论依据，起到参考作用。

1 猪精液常温保存技术

猪精液的保存根据其保存温度的不同分为常温保存、低温保存和冷冻保存。由于公猪精子膜结构的特殊性使之对低温特别敏感，容易产生冷应激。猪精液进行冷冻保存后冻融精子的活力不易恢复，且受精能力和受孕率都不高，这限制了冷冻保存精液的使用[4]，所以生产中常常采用常温保存精液。

猪精液常温保存是指将稀释后的精液在15～25 ℃的条件下保存的技术，又称为室温保存。常温保存主要是采用弱酸环境抑制精子活动和代谢，减少能量的消耗，再恢复pH等环境条件又使精子复苏的原理来达到保存精液的目的。在猪精液常温保存过程中会受到温度、渗透压、pH、稀释倍数、抗氧化剂、缓冲剂、细菌等多种因素的影响[5]。而随着保存时间的延长引起精液质量不断下降的两大因素就是活性氧和微生物，过量的活性氧会对精子的结构和功能产生损伤，而微生物的滋生会大量消耗精子的营养物质，并增加猪生殖机能降低的风险。目前，猪精液常温保存稀释粉种类非常多，但大多数都是美国、丹麦、日本、法国等国外专利产品。为了提高产品竞争力，国内研究者也在不断努力研制国产稀释粉产品，研究通过添加抗氧化剂、抗菌剂、中草药提取物等提高猪精液的保存效果[6]。维生素E、谷氨酰胺、谷胱甘肽、褪黑激素、五味子乙素和牛磺酸等常作为抗氧化成分用于猪精液常温保存，来减缓氧化应激对精子造成的影响，提高精液保存质量[7]。

2 猪精液常温保存稀释粉

一般情况下，稀释粉配方应该满足以下要求：首先是在为精子提供营养物质的同时对精子没有毒副作用；其次是稀释粉pH、渗透压要适宜精子存活；最后是稀释粉的原料成本较低，成分简单。

常温保存稀释粉按保存精液的时间长短分为短效稀释粉(1～3 d)、中效稀释粉(4～5 d)和超长效稀释粉(7～14 d)三种[8]。规模化猪场通常使用短效稀释粉，因为其成分相对简单。常见的短效稀释粉有BTS、Kive和BL-1，其中保存效果和适用性最高的是BTS。中效稀释粉的种类较多，有效保存精液时间为4～5 d。而长效稀释粉通常都可以保存5d以上，成分相对于其他两种要复杂一些，其中Diltec能有效保存精液5～10 d，而力之源则可以有效保存精液长达7～14 d[9]。

2.1 营养物质

精子在常温保存过程中需要消耗能量来维持其代谢和运动、完成获能、超活化和顶体反应。精子的代谢活性以及它们在体外保存后利用ATP的能力，决定了精子的能量状态，体外保存精子的受精能力可能受到可用ATP数量的限制[10]。精子在体外常温保存时，精子细胞除了消耗自身很少的ATP外，主要通过稀释液中的糖类来获取能量，此外稀释液中的糖类还能够维持精液渗透压的动态平衡。常添加的糖类主要有葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、葡聚糖和海藻糖等，而葡萄糖因为价格低廉应用最为广泛[11]。其中果糖和葡萄糖这样分子量低的糖可以穿过精子质膜，而像蔗糖、海藻糖和葡聚糖则不能穿过精子质膜，但是其可以和质膜中的磷脂相互作用，从而稳定精子膜蛋白质-脂类复合物，起到保护精子膜的作用，提高精子活率。高建明等[12]研究发现，在猪精液常温保存稀释液中添加1.5 g/L海藻糖可以提高精液保存效果。潘红梅等[13]研究发现，用66.7%的蔗糖与33.3%的乳糖组合添加，精子活力达37.0%，显著高于其它各组，说明在稀释液中添加乳糖能够提高猪精子活力。因此，在猪精液常温稀释粉配方中，营养物质至关重要，它能够为精子的代谢及其运动提供能量，保障精子能够完成受精。

2.2 缓冲剂

新鲜猪精液的pH为7.2～7.5，若是pH低于这个范围，将会对精子活力产生较大的影响。弱酸性环境更适宜精子的生存，更有利于精液的常温保存，能够提高精液的常温保存效果。精子的主要代谢途径是糖酵解，在代谢过程中会产生乳酸等酸性物质降低环境中的pH[7]。过多酸性物质的积累会导致精子代谢过程减慢甚至出现精子酸中毒死亡现象[14]。在精液常温保存过程中，为了保持其内环境的相对稳定，添加适量的缓冲剂变得非常必要[15]。目前常用的缓冲剂主要有柠檬酸钠、碳酸氢钠、HEPES、MOPS、TES和Tris等。鲜红等[16]研究发现，Tris的缓冲效果要优于NaHCO3-柠檬酸钠体系，Tris作为缓冲剂可以显著增加精液常温保存的时间。由此可见，在猪精液常温稀释液中添加一定量的缓冲剂可以维持精子细胞外环境的相对稳定，增加精液常温保存的时间，从而提高精液保存效果。

2.3 抗菌剂

在猪精液常温保存过程中，适宜的温度、pH、渗透压和营养物质等环境容易引起细菌微生物的滋生，对精液保存质量造成不良影响。大量滋生的细菌微生物会与精子争夺稀释液中的营养成分，而细菌微生物的代谢产物会对精子的生存造成危害，导致精子细胞死亡。Althouse等[17]研究发现细菌体内的凝集因子会使得精子发生凝集效应，改变精液稀释液的渗透压，造成精子顶体肿胀破损，精子进行无氧发酵产生酸性物质，使精液稀释液的pH下降，严重影响到精液的保存时间和质量。常见的细菌有沙门菌、变形杆菌、大肠杆菌、棒状杆菌、葡萄球菌、链球菌等。

猪精液中的细菌污染源主要分为动物源和非动物源两种。因此，在采集精液和处理精液时加强卫生管理，可以减少非动物源的细菌污染；同时也可以加入抗生素来抑制细菌微生物的生长繁殖[18]。在猪精液常温保存中，为了提高精液保存质量，通常会添加合适浓度的抗生素对细菌微生物的生长繁殖进行抑制。添加抗生素可以有效抑制细菌的繁殖，能够有效增加精液保存的时间，提高母猪受胎率[19]。庆大霉素在猪精液稀释液BTS中的标准添加量为0.25 g/L。刘兆军[20]研究表明，在BTS中添加0.2 g/L的双乙酸钠替代40%的庆大霉素，可以起到和标准添加量相同的保存效果。

随着抗生素的广泛应用，越来越多的研究发现猪精液中常见的一些细菌已经出现了耐药性，而且一些喹诺酮类抗生素由于存在食品安全问题已被国家农业部禁用。所以，研发新型的抗生素替代物变得至关重要。抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)作为一种具有广谱抗菌性的天然物质，受到广泛的关注。Puigtimonet等[21]研究发现，在猪精液稀释液中添加3 μM的两种抗菌肽，猪β防御素-1(PBD1)和猪β防御素-2(PBD2)，可以抑制一部分细菌的生长。虽然AMPs具有广谱、快速的杀菌活性以及低耐药性，但研究发现一些特定的AMPs对精子细胞有毒害作用[19]。因此，人们在寻找更多的新型抗生素替代物，希望能够替代抗生素广泛应用在猪精液常温保存中。王健[22]研究表明，稀释液中添加80 μM的蛋氨酸碘能够显著抑制变形杆菌属、葡萄球菌属以及假单胞菌的生长繁殖，从而改善了公猪精子的活力和质膜完整性，提高了猪精液常温保存效果。魏宁等[23]研究发现，在猪精液稀释液中添加0.16 g/L的ε-聚赖氨酸最多可替代75%标准添加量的庆大霉素。溶菌酶是一种抗菌物质，能够直接作用于细菌的细胞壁起抑菌作用。邓昌海[24]研究发现，在稀释液中添加2.0 mg/mL的溶菌酶在猪精液常温稀释液中能显著提高精液的活力以及质膜顶体完整率。因此，在猪精液常温稀释液中添加合适浓度的抗生素类替代物的抗菌剂能够提高精液保存质量，同时又不会使细菌产生耐药性，有助于加强畜产品生物安全。

2.4 抗氧化剂

在正常生理情况下，精液具有一定的抗氧化能力。精子在代谢过程中会产生一定量的活性氧(Reactive oxygen species，ROS)。合适水平的ROS对精子结构以及功能的成熟等有一定的有利作用[25]，同时对维持精子体内稳态、精子发生细胞的生长、精子的获能、增加顶体反应发生率等具有促进作用[26]。当精子中积累的ROS超出了精子自身的抗氧化能力后，会对精液的质量造成不良影响，这是因为公猪精子比较特殊，精子质膜中不饱和脂肪酸、磷脂酞乙醇胺和鞘氨醇较高，这些脂类极易受到ROS的攻击而产生脂质过氧化物丙二醛等，使精子产生氧化应激反应，从而对精子产生毒害作用，造成精子质膜、顶体、线粒体损伤[27]。而抗氧化剂能够有效的抑制或者减缓自由基的产生，从而调节精子细胞氧化还原平衡，减少氧化应激反应的发生，降低精子细胞受到的氧化损伤。因此，为了降低ROS对精子的氧化损伤，在稀释粉中添加抗氧化剂成为保护精子在保存过程中免受氧化应激的有效方法。

抗氧化剂主要包括酶类和非酶类抗氧化剂。酶类抗氧化剂包括谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽还原酶(GR)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶等。谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶能够通过将过氧化氢还原成水分子来清除过氧化氢从而起到抗氧化作用。非酶类抗氧化剂主要有α-硫辛酸、褪黑素、谷胱甘肽、类胡萝卜素、维生素类、铜、锌、硒等。谷胱甘肽是一种强的抗氧化剂，谷胱甘肽分子中的巯基容易被氧化脱氢，从而将细胞内的过氧化氢还原成水，清除细胞内自由基，减少自由基对细胞造成的氧化损伤。褪黑激素(Melatonin )是一种有很强抗氧化性能的内源性抗氧化剂，能够有效清除细胞中自由基，减少氧化损伤。维生素E作为亲脂性抗氧化剂，带有过氧化氢自由基清除基团(LOO)，能够保护精子质膜中多不饱和脂肪酸免受过氧化损伤。

Ajina等[29]研究表明，维生素E和锌都能起到一定的抗氧化作用，能够提高精子的活率。何兰花等[30]研究发现，添加维生素E的猪精液常温保存稀释液能够有效提高精子活率，从而改善精液品质。朱林炜[11]研究发现，在BTS中添加1 mmol/L的GSH精子活率最高0.753，添加200 IU/mL SOD精子活率最高(0.683±0.006)，两者都能够增强猪精液常温保存的效果。在猪精液常温稀释液中添加0.5 μmol/L虾青素，能够提高精子的活力[31]。所以，在猪精液常温稀释液中添加合适浓度的抗氧化剂能够显著提高精液保存质量，延长保存时间，从而提高精液保存效果。

2.5 无机盐离子

在猪精清中含有Na+、K+、Ca2+、Mg2-、Cl-、P043-以及HCO3-等无机离子。K+有利于维持精子的运动能力；而过量的HCO3-会导致腺普酸环化酶的异常活化，从而诱导精子提前获能，不利于精液在体外常温保存；同样当Ca2+浓度过高时，也会导致精子的提前获能和顶体反应，影响精液品质[32]。六价铬是一种广泛存在的重金属离子，精液中的六价铬会使精子受到氧化应激损伤。所以，在配制常温稀释液时应该使用去离子水，同时为了维持稀释液pH和渗透压的动态平衡，稀释液配方中的无机盐离子种类和添加浓度都应该严格控制。同时，为了避免Cu2+和六价铬等有害金属离子对精子造成损伤，通常会在稀释液中加入适量具有鳌合作用的EDTA[33]。所以，在猪精液常温稀释液中添加合适种类、适宜浓度的无机盐离子能够维持稀释液的pH和渗透压动态平衡，可以适当延长猪精液体外保存时间，有效提高精液保存质量。

2.6 其他保护剂

牛血清白蛋白(BSA)是一种蛋白类保护剂，通过中和精子产生的有害代谢物从而稳定精子的结构，维持精子运动状态和减少精子凝集，从而对精子起保护作用，BSA是一种良好的精子保护剂[34]。Shannon等[35]研究发现，牛血清白蛋白有利于维持精液-稀释液体系胶体的渗透压平衡，同时能够提高精子质膜和顶体完整性。在不同剂量BSA对猪精液常温保存效果的研究中发现，添加4 g/L BSA的稀释液的精子活率显著高于其他组[36]。此外，也有研究发现添加适量的脱脂奶粉可以有效改善猪精液常温保存效果[37]。刘琦[34]研究了四种氨基酸类保护剂三七皂甙R1、L-谷氨酞胺(Gln)、牛磺酸(Tau)和中药活性成分五味子乙素(Sch B)对猪精液常温保存效果的影响，发现添加5 mmol/L的三七皂甙R1、4 mmol/L的Gln、5 mmol/L的Tau以及15 μmol/L的Sch B可以显著提高精子活率0.69，0.70，0.70，0.71，提高精液常温保存效果。因此，在猪精液常温稀释液中添加适量的牛血清白蛋白、脱脂奶粉等其他保护剂，能够有效改善猪精液常温保存效果。

3 展 望

随着我国现代化养猪业发展越来越迅速，人工授精技术的普及率也越来越高，所以研发出保存效果更好的猪精液常温保存稀释粉变得迫在眉睫。目前，市面上有许多新开发的添加剂在猪精液常温保存稀释粉中应用，但是它们的最佳添加量及其作用的机理还有待进一步的研究。而这些新型添加剂的研发和应用对进一步完善猪精液常温保存技术起着重要作用，对推进我国养猪业集约化发展有着重大意义。