单细胞转录组测序技术及其应用研究进展

巴黎根·达列力汗 , 常铤晋, 汪富文, 王朝飞, 党瑞华

(西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100)

随着二、三代测序技术不断发展和迭代，单细胞测序(single cell sequencing, SCS)领域开始迅猛发展，单细胞转录组测序技术已广泛应用于各个领域。为了描述机体发育或者疾病发展过程中细胞类型的多样性，揭示各种类型细胞发挥的功能与机制，需要研究单个细胞之间产生的基因表达差异。单细胞转录组测序(single-cell RNA sequencing, scRNA-seq)技术在单细胞水平上，首先需要从组织或体液样本中的细胞群分离出单个细胞，通过无偏、高通量和高分辨率的转录组测序，从而获得相关数据，最后进行信息分析[1]。scRNA-seq方法目前在肿瘤、生殖、组织器官、免疫、神经发育、动物遗传育种等领域被广泛应用。

1 单细胞分离技术

单细胞分离是将组织或体液样本中的细胞群分离成单个细胞，常用的方法包括：连续稀释法、显微操作法(Micromanipulation)、激光捕获显微切割法(Laser capture microdissection, LCM)、荧光激活细胞分选法(Fluorescence-activated cell sorting, FACS)和微流控法(Microfluidics)等。

2 scRNA-seq技术

Eberwine等[2]报道了体外转录线性扩增技术，Brady等[3]报道了PCR扩增单个细胞的互补DNA(cDNAs)技术，这种技术与高通量测序技术相结合，衍生出了scRNA-seq技术。Fluidigm、WaferGen、10×Genomics和Illumina/Bio-Rad等测序平台是目前最常见的单细胞测序平台。scRNA-seq技术之所以不同于其他RNA测序技术，是因为它先分离出单个细胞后，再进行RNA转化成cDNA，并通过扩增来生成高通量的测序方法。生物学研究中的很多新思路都是通过scRNA-seq技术发现的，例如新细胞类型的鉴定，再到后来的随机基因表达全局模式的研究，也实现了通过多组学来揭示生物发育调控机制[4]。

3 单细胞转录组测序的应用

3.1 在肿瘤研究领域的应用

正常细胞通过不断积累突变进化形成肿瘤细胞，在进化过程中由于恶化的细胞之间基因突变或表达谱的多样化，形成不同类型细胞或同种类型细胞的不同亚型，导致肿瘤细胞间普遍存在异质性，这对于临床诊断及治疗带来了严重的影响[5]。scRNA-seq技术为描述克隆多样性和了解稀有细胞在肿瘤研究中的作用提供了新的工具。

Ren等[6]通过scRNA-seq检测患者及对照组胰腺导管腺癌(PDAC)肿瘤样本，揭示了肿瘤干细胞(CSC)样导管细胞向具有侵袭性导管细胞转化的轨迹，并筛选出了CSC相关基因(CRGs)。Song等[7]对4例早期非小细胞肺癌(NSCLC)患者的肿瘤和邻近正常组织的细胞组成和转录动态进行了scRNA-seq分析，发现骨髓细胞群在肿瘤和正常组织之间表现出最多样化的变化，这与肿瘤介导的重编程一致，通过轨迹分析，确定了从CD14+单核细胞到M2巨噬细胞的分化路径。Yu等[8]研究显示，大多数双侧肾细胞癌(RCC)细胞类型的基因表达高度相似，但不同部位肿瘤细胞的基因表达存在显著差异。此外，通过GO分析确定了不同肿瘤细胞类型的潜在生物学功能，为RCC的诊断和治疗提供了新的思路。Zhou等[9]使用scRNA-seq对2075个肿瘤细胞进行测序，筛选出2940个细胞标记，又对396例膀胱癌患者进行瘤内异质性评估，鉴定出96个瘤内异质性相关基因；通过Lasso和Cox多元回归建立8对基因模型用于评估癌细胞的总生存率，这有助于临床治疗结果的预测。

Dai等[10]利用scRNA-seq分析结肠直肠癌患者肿瘤组织中的2824个细胞，研究表明，可以将细胞分为5个不同的簇，每个簇内的基因存在不同的功能。Zhang等[11]对胆囊癌(GBC)肝转移组织进行了10X Genomics scRNA-seq，确定了8种细胞类型，共7788个细胞，研究发现，恶性肿瘤细胞表现出高度的瘤内异质性，中性粒细胞与促进GBC细胞的增殖、迁移和侵袭有关，巨噬细胞在肿瘤微环境中发挥重要作用。Wang等[12]使用scRNA-seq对3例胃癌患者的原发癌和成对的转移性淋巴结癌组织进行了分析，确定了胃癌淋巴结转移标记基因(ERBB2，CLDN11和CDK12)以及潜在的胃癌进化驱动基因(FOS和JUN)。循环肿瘤细胞(circulating tumor cell, CTC)是由肿瘤原发灶或转移灶经过侵袭、脱落进入血液循环的肿瘤细胞[13]。Sun等[14]使用scRNA-seq对肝细胞癌(HCC)患者的肝静脉(HV)、外周动脉(PA)、外周静脉(PV)和门静脉(PoV)等4个不同血管部位的113个单个循环肿瘤细胞(CTCs)进行分析，发现在血液运输过程中，CTCs的转录动态与应激反应、细胞周期和免疫逃逸信号有关；此外，还发现了趋化因子CCL5是CTCs免疫逃逸的重要中介因子。

3.2 在发育生物学研究领域的应用

3.2.1 生殖系统方面 单细胞测序技术最早运用于生殖生物学，但是仍然存在很多需要探索并解决的问题。卵母细胞的正常发育为生命的延续提供了保障。He等[15]对小鼠新生儿(P0.5)卵巢单个生殖细胞进行了RNA-seq检测。通过分析，建立了卵母细胞发育的统一轨迹。GO富集分析显示减数分裂相关基因显著减少，卵母细胞特异性基因显著增加，标志着从生殖细胞向功能性卵母细胞的转变。另外，系统地重建了卵母细胞的分子级联结构，确定了卵泡形成和发育的一系列基因和分子通路。

精子的受精能力和前进动力都是在附睾运输过程中获得的，这些能力的获得说明了附睾的重要性。虽然有附睾细胞图谱的报道，但附睾管内细胞的异质性和基因表达谱仍是未知数。Shi等[16]应用scRNA-seq研究了小鼠附睾细胞组成及其亚群，附睾段差异表达基因及线粒体相关基因的时空表达差异，全面提供了附睾单细胞水平的解析图谱。研究结果还表明，附睾体和尾侧上皮细胞线粒体水平升高可能参与了精子成熟过程。Law等[17]利用scRNA-seq对小鼠的精原干细胞(SSC)进行发育动力学研究，确定了前精原细胞在胎儿晚期和新生儿发育过程中经历的动态轨迹。

3.2.2 组织器官发育方面 Haber等[18]报道了首个高分辨率的小鼠小肠和类器官的基因表达图谱，使得之前未知的小肠上皮细胞亚型及其基因标记的鉴定成为可能，为揭示肠道内环境稳定以及应对病原体入侵提供了新的线索。Santos等[19]用scRNA-seq对小鼠尿路上皮类器官进行分析，发现有5种细胞类型，结合γ-分泌酶抑制剂的使用，证实Notch信号通路参与类器官的分化。Seow等[20]用scRNA-seq分析了5种不同的肝组织类型约30万单个细胞，以确定可能涉及COVID-19病毒侵入的肝细胞类型，报道了血管紧张素转换酶2和跨膜丝氨酸蛋白酶2在TROP2+肝祖细胞中的共表达，发现在冠状病毒(COVID-19)相关的肝功能障碍和细胞死亡中，TROP2+肝祖细胞的病毒感染可能显著损害患者的肝脏再生。单细胞测序技术在肾脏上也有着大量的研究，小鼠肾脏的性别、谱系和区域多样性的单细胞测序技术应用进一步推进了人类疾病建模和受损系统修复研究的快速进步[21]。Jia等[22]利用scRNA-seq技术描述了糖尿病模型小鼠的肾小球细胞中糖尿病肾病的动态变化，鉴定了五种不同的细胞群，包括肾小球内皮细胞、系膜细胞、足细胞、免疫细胞和肾小管细胞，并确认了肾小球细胞特异性标记基因和几个新的肾小球细胞潜在标记基因。

3.2.3 免疫学方面 Monika等[23]应用PCR技术，发现CD8+T细胞在多发性肌炎患者肌肉和血液组织中克隆性增生，随后结合CDR3光谱分析、激光显微解剖和单细胞PCR技术分析了其扮演的病理角色。Savas等[24]使用scRNA-seq分析了人乳腺癌中6311个T细胞，发现CD8+TRM与患者生存率提高相关，有更好的预后，并推测CD8+TRM参与对乳腺癌的免疫监测，可能是免疫检查点疗法的关键靶点。CD4+细胞毒性T淋巴细胞(CD4-CTL)在几种病毒感染中发挥保护作用。然而，人类对CD4-CTL生成的生物学、功能特性和异质性知之甚少，特别是与其他描述良好的CD4+记忆T细胞亚群的关系。Patil等[25]通过对9000多个细胞的单细胞测序数据分析，阐明了人类CD4-CTL的异质性、转录谱和克隆性。不同免疫细胞的异质性也能够通过单细胞测序去分析[26]，在器官水平上，有关于肾脏免疫排斥的单细胞测序研究更进一步解释了器官水平的排斥反应[27]。特应性皮炎(AD)是一种流行的炎症性皮肤病，发病机制复杂，涉及免疫细胞和表皮异常。He等[28]使用单细胞RNA测序，评估AD患者与对照组皮肤中细胞组成和细胞特异性基因表达的区别。除此以外，心脏的炎症免疫机制也通过单细胞测序作了一定的研究。Martini等[29]使用单细胞RNA测序来绘制标准鼠非缺血性、压力过载心力衰竭模型中的心脏免疫组成。通过将分析重点放在CD45+细胞上，获得了对心脏、疾病早期和晚期以及对照中免疫细胞亚群的更高分辨率的识别。然后在小鼠和人类中使用流式细胞术、免疫组织化学染色等技术整合，最终得出心力衰竭模型中免疫激活的程度分布。

3.2.4 神经系统方面 哺乳动物神经系统的细胞组成和功能具有很高的异质性和复杂性，了解神经系统的机制需要了解神经系统中各种细胞类型之间的相互作用。Lake等[30]报道了改进的微流体的单核测序(single-nucleus droplet-based sequencing, snDrop-seq)和单细胞转座体超敏性位点测序(single-cell transposome hypersensitive site sequencing, scTHS-seq)方法，对成人大脑视觉皮层、额叶皮层和小脑的6万多个单细胞进行检测，揭示了构成细胞类型差异性的调控元件和转录因子，还将疾病相关的风险变异映射到特定的细胞群体中，这为人类大脑中正常和致病的细胞过程提供了见解。Wang等[31]对健康和红色斑点石斑鱼神经坏死病毒(RGNNV)感染的鱼的中脑进行了scRNA-seq分析，确定了28个神经元细胞和7个非神经元细胞类型。高深度的单细胞测序分析还解释了小胶质细胞和脑髓样细胞的发育异质性[32]。人、小鼠和干细胞的中脑发育机制也借助于单细胞测序技术对其进行了更深入的了解[33]。2020年，小鼠肠道神经系统的单细胞图谱被成功绘制出来[34]。在此之前，就有研究者利用单细胞测序技术确定了结肠感觉神经元存在7个亚型[35]。除此以外，为了促进单细胞的扩展分析，全新的SPLiT-seq测序技术也被应用于小鼠的大脑和脊髓，进一步提供了鼠中枢神经系统出生后早期发育的快照[36]。

3.3 在动物科学研究领域的应用

单细胞测序技术主要应用在组织器官发育、疾病发生及免疫学领域，在动物科学领域目前研究较少，主要集中在动物繁殖、胚胎发育及肌肉组织方面。FecB基因上的一个错义突变显著影响小尾寒羊的产羔率，郭晓飞等[37]研究发现，FecB基因主要在卵丘颗粒细胞中表达，且突变后其下游SMAD4基因和相关繁殖激素受体基因(FSHR、LHCGR)的表达量差异显著；FecB基因突变后，可通过激素受体基因的表达差异来调控激素信号的接受能力。张恒[38]利用高通量转录组测序等先进分子技术，研究确定了猪合子基因组激活发生在四细胞到八细胞时期；通过与人、小鼠、牛基因表达调控网络进行比较，发现相比于小鼠、猪等大动物的早期胚胎发育调控网络可能与小型动物存在巨大的差别[38]。

基于单细胞测序技术，对分别利用卵胞浆内单精子显微注射技术(Intracytoplasmic sperm injection, ICSI)和体细胞核移植技术(Somatic cell nuclear transfer, SCNT)得到的两组猪植入前各时期胚胎的转录组进行系统分析，在ICSI组相邻时期间共鉴定得到9931个差异表达的蛋白编码基因(differentially expressed gene, DEG)；在ICSI组和SCNT组胚胎发育的各个时期，鉴定出数量差别很大的可变剪切基因，发现在各个时期均表达的可变剪切基因主要发挥如RNA剪切和细胞周期等基础的功能；在ICSI组和SCNT组相同时期间共鉴定得到6080个DEGs，其中在8细胞期DEGs数量最多，囊胚期次之，这些DEGs主要在RNA加工运输、脂质代谢和信号转导等方面发挥作用[39]。

肌内脂肪(Intramuscular fat, IMF)是影响肉品质的重要因素之一，由于不能直接从鸡的肌肉组织中分离出IMF，传统测序方法检测的IMF的基因表达容易受到肌肉细胞的影响，因此，通过scRNA-seq技术对两个不同发育阶段的胸肌组织进行检测，发现了11个表达差异显著的基因，包括7个可作为IMF沉积的重要候选基因，再结合RNA原位杂交验证鉴定出了IMF细胞特异性表达基因[40]。

4 总结与展望

单细胞转录组测序技术实现了对单个细胞的无偏性、高通量以及高分辨率的转录组分析，为转录组信息提供了一个相对于传统的描述大量细胞群的方法外的额外维度，已成为揭示组织组成、转录动力学和基因间调控关系方面的新一代分析技术。目前，scRNA-seq大多应用于肿瘤、生殖、组织器官、免疫、神经发育等领域，在动物遗传育种研究领域的报道较少。由于scRNA-seq操作过程相对繁琐，而且目前的检测主要集中在mRNA，对于非编码RNA的检测还存在一定困难，但随着各种测序平台及算法的产生，多领域技术的进步和融合，单细胞转录组测序技术必将会有新的突破和进一步发展。