柯萨奇病毒B3产生的2B蛋白影响钙信号转导并抑制细胞凋亡的研究进展

杨阳，刘文秀，王丹，郑诗悦，赵德超

(哈尔滨医科大学附属第一医院心血管内科，哈尔滨 150001)

心肌炎是一种由多种原因引起的心脏炎症，与病毒感染密切相关，即病毒性心肌炎[1]。病毒性心肌炎患者的临床表现轻重不一，轻者导致呼吸困难，重者可出现急性心力衰竭，患者的临床结果由病毒毒力、免疫反应以及治疗干预间相互作用共同决定，而细胞凋亡在其中发挥重要作用[2-3]。细胞凋亡包括内源性凋亡和外源性凋亡，内源性凋亡又分为内质网途径凋亡和线粒体途径凋亡，因此在病毒性心肌炎的研究中心肌细胞凋亡的机制至关重要。与人类心肌炎相关的病毒包括肠道病毒、腺病毒、疱疹病毒以及人类免疫缺陷病毒等，而肠道病毒中的柯萨奇病毒(coxsackievirus，CV)B3是患者心肌活检中最常见的病原体之一[4-5]。2B蛋白是CVB3产生的一种关键非结构蛋白，具有Viroporin样活性，可插入细胞膜及细胞器膜中，影响宿主细胞膜的生物学功能、破坏宿主细胞内钙离子(Ca2+)的稳态，进而参与细胞凋亡的调节[6]。作为细胞内重要的细胞器，内质网和线粒体共同维持细胞内的Ca2+稳态，同时也参与细胞内源性凋亡的过程[7]。现就CVB3产生的2B蛋白影响钙信号转导并抑制细胞凋亡的研究进展予以综述。

1 小RNA病毒CVB3

1.1CVB3的结构特点 小RNA病毒科包括肠道病毒(如CV和脊髓灰质炎病毒)、鼻病毒(如人鼻病毒)等[5]。小RNA病毒均具有相似的基因组结构，其RNA基因组为6.7～10.1 kb，通常由7 500～8 000个核苷酸正链RNA分子组成，包含1个长的开放阅读框、1个5′非翻译区、1个3′非翻译区和1个多聚腺苷酸尾[8]。开放阅读框翻译的RNA基因组会产生1个约2 200个氨基酸的多聚蛋白，该多聚蛋白分为P1、P2和P3区域，P1区域是包裹病毒RNA的结构性蛋白，P2和 P3区域是参与病毒RNA复制的非结构性蛋白[8-10]。

CVB3的遗传信息存储在1个长7.4 kb的小型单链RNA中，CVB3进入细胞后，首先将小型单链RNA翻译成1个单一的多聚蛋白，然后多聚蛋白被蛋白酶切割成单一的病毒蛋白[9]。CVB3可编码产生4个结构蛋白和7个非结构蛋白，其中结构蛋白以正确的方式聚集在一起，形成病毒衣壳，而非结构蛋白具有协同作用，可使病毒接管宿主细胞，确保宿主细胞产生病毒RNA，同时使细胞膜裂解，将组装好的CVB3颗粒释放到细胞外液中，因此非结构蛋白及其前体在宿主细胞内具有多样而各异的功能[9-10]。

1.2CVB3感染及损伤途径 CV通过粪口途径传播导致人类或小鼠的心肌炎症，特别是CVB3。首先CVB3通过宿主肠黏膜感染并在派尔集合淋巴结、脾脏的淋巴细胞和巨噬细胞中复制，然后CVB3被释放到血液中并传播至各器官(如心脏和胰腺)[4]。目标细胞对病毒的内化是通过其与2个表面因子的相互作用完成，首先衰变加速因子将病毒颗粒锚定到细胞表面，然后人类和小鼠共有的CV-腺病毒受体介导CVB3进入细胞，而心肌细胞将病毒内化是CVB3诱导心肌炎发生的前提条件[11]。在感染的宿主细胞中可以看到细胞质中膜囊泡的大量增殖和积累，这些囊泡即是病毒RNA复制的部位[12]。

病毒感染可诱发宿主细胞内源性和外源性的凋亡途径以及先天性免疫和获得性免疫反应。大多数病毒在长期共同进化的宿主关系中获得了调节感染、限制宿主免疫反应的能力。CVB3通过编码多功能蛋白调控病毒繁殖以及逃避宿主细胞的免疫反应，这些非结构蛋白不仅可影响宿主细胞膜运输系统和蛋白运输过程，还参与破坏宿主细胞的形状并干扰其正常生理功能，以确保整个病毒生命周期的顺利完成[9-10,13]。

2 2B蛋白

2.12B蛋白的结构 2B蛋白是CVB3产生的关键非结构蛋白，也是具有99个氨基酸残基的跨膜蛋白，由2个疏水区域(hydrophobic region，HR)组成，即HR1和HR2。HR1是两亲性的α-螺旋，HR2则形成完全疏水的螺旋；HR1和HR2与连接的茎环相互作用形成“螺旋-角-螺旋”结构，而这样的结构可以在脂质双分子层中以四聚体的形式组装成亲水性孔[6,13]。研究表明，2B蛋白与细胞器膜或细胞膜的正确结合及改变膜通透活性均需要HR1和HR2的共同存在，2B蛋白在CVB3的生命周期中起关键作用，可通过诱导一系列宿主细胞反应，促进CVB3的复制和释放[14]。

2B蛋白是病毒孔蛋白Viroporins家族的一员，而Viroporins是低分子量跨膜蛋白家族，包含50～120个氨基酸，其作用方式是单体聚合形成亲水孔后嵌入宿主细胞膜发挥功能[14]。Viroporins分为ⅠA、ⅠB、ⅡA和ⅡB 4种亚型，其中ⅡA型的C端和N端延伸至细胞器腔，而2B蛋白在结构上即属于ⅡA型，即C端和N端均位于细胞器的腔内[14-15]。病毒编码的Viroporins不仅与病毒致病性相关，还参与调节宿主细胞的电化学平衡，并影响病毒的复制，因此Viroporins家族有望成为抗病毒治疗的潜在靶点[16-17]。

2.22B蛋白的膜定位和功能 2B蛋白的特定结构决定了其膜定位，特别是在细胞膜、高尔基体膜和内质网膜中。2B蛋白在细胞膜、高尔基体膜和内质网膜中形成孔隙，破坏了膜的完整性，可诱导膜重塑并阻滞蛋白的运输[6,9]。已有研究证明，2B蛋白单独表达即可诱导Ca2+稳态的改变，免疫组织化学染色显示，2B蛋白通过影响质膜通透性使细胞外Ca2+流入，导致胞质内Ca2+水平升高；同时还可导致内质网内的Ca2+外流，内质网Ca2+外流可破坏内质网的稳态，诱导形成内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，促进细胞凋亡并导致线粒体Ca2+吸收减少[6,18]。以上研究均表明，CVB3产生的2B蛋白单独表达即可导致质膜通透性增强。

3 正常情况下内质网与线粒体间的钙信号转导

内质网是细胞内最大的Ca2+储存库和钙信号转导的主要部位[19-20]。内质网通过特定的Ca2+通道保证摄取和释放之间的平衡。其中，内质网的Ca2+摄取仅通过心肌肌质网Ca2+-ATP酶以ATP依赖性方式将Ca2+主动泵入内质网内，而内质网的Ca2+释放受兰尼碱受体和肌醇1，4，5-三磷酸受体(inositol 1，4，5-trisphosphate receptors，IP3Rs)控制，Ca2+本身对兰尼碱受体和IP3Rs有双相调节作用，低水平Ca2+可激活Ca2+摄取通道，而高水平Ca2+可抑制Ca2+摄取通道开放[7，10，19]。

正常情况下，线粒体通过调节钙信号转导调控ATP生成的关键酶，从而为细胞提供能量[20]。线粒体膜分为线粒体内膜和线粒体外膜，而线粒体外膜上具有电压依赖性阴离子通道受体。研究表明，电压依赖性阴离子通道与IP3Rs间存在物理连接，Ca2+通过电压依赖性阴离子通道进入线粒体外膜，在线粒体外膜与线粒体内膜的接触位点富集着线粒体钙单向转运蛋白完整复合物，该复合物同样参与Ca2+的摄取[7,20]。

线粒体基质中的Ca2+积累主要通过线粒体钙单向转运蛋白和线粒体内膜上存在的膜电位完成。在静息生理条件下，线粒体钙单向转运蛋白对于细胞质内Ca2+的亲和力较低，因此Ca2+的吸收速率非常慢，但内质网-线粒体连接可以克服Ca2+摄取系统的低亲和力，由内质网释放的Ca2+在局部即可达到较高水平[7]。因此，高水平的“Ca2+热点”可以在内质网膜与线粒膜之间紧密靠近的区域内短暂形成，在内质网与线粒体紧密结合位点间形成的这个具有高Ca2+水平的微域被称为线粒体相关膜[7,21-22]。线粒体相关膜允许线粒体基质内大量Ca2+的快速吸收，导致线粒体代谢快速调节以满足细胞的需求[23]。内质网与线粒体可通过多种方式影响细胞生物功能，因此，内质网-线粒体连接的正常稳态与细胞存活直接相关，维持内质网与线粒体间的适当间隔和离子转运对细胞正常功能至关重要[23-24]。

4 2B蛋白通过影响内质网-线粒体的钙信号转导抑制细胞凋亡

4.1Ca2+与细胞凋亡的关系 细胞凋亡是由各种刺激引起的细胞死亡过程，该过程通过两个途径实现：①外源性途径，激活细胞表面的死亡受体Fas或CD95；②内源性途径，包括线粒体膜通透性增加和ERS的发生。传统观点认为，CVB3感染后直接触发细胞凋亡反应，导致细胞膜被破坏，使细胞外Ca2+大量涌入致线粒体内Ca2+超载，进而导致细胞凋亡[9,14]。从生理功能控制到死亡程序的转换均涉及Ca2+的严格调控或细胞器Ca2+水平的改变，因此破坏细胞质和细胞器内的Ca2+稳态即可通过凋亡或坏死途径导致细胞死亡[25]。

4.22B蛋白通过激活ERS影响内质网途径的凋亡 在CVB3感染的细胞中，2B蛋白与Ca2+水平变化密切相关。CVB3产生的2B蛋白可使被感染细胞内质网腔内的Ca2+外流，进而导致内质网腔内的Ca2+水平降低，同时导致线粒体摄取Ca2+减少[6,9-10]。2B蛋白是通过内源性途径调节细胞凋亡，这种途径包括ERS和线粒体途径[6]。多种内外环境刺激(如内质网内Ca2+代谢紊乱)均可引起ERS并激活未折叠蛋白反应，进而启动一系列下游信号，对蛋白合成与降解比例进行适应性调整，以恢复内质网的正常功能，维持细胞内的稳态；但持续或过度的Ca2+从内质网中被释放入细胞质则会刺激内质网附近的钙调蛋白分解酶作用于胱天蛋白酶12，使之活化并释放入细胞质，激活相关的凋亡信号通路[26-27]。

4.32B蛋白通过减少线粒体Ca2+吸收影响线粒体途径的凋亡 线粒体内Ca2+水平过度升高是高细胞毒性的，过量的Ca2+负荷可导致线粒体膜通透性转换孔打开、线粒体渗透肿胀和外膜破裂以及细胞色素C等促凋亡因子释放，这也是导致线粒体途径细胞凋亡的关键原因[6,28]。有研究提出了一种可能机制，即宿主细胞凋亡信号经促分裂原活化的蛋白激酶通路传递给线粒体，导致细胞色素C被释放并作用于内质网的IP3Rs，使内质网释放入线粒体的Ca2+增加，直至达到线粒体内的Ca2+超载，但当2B蛋白插入内质网后，内质网腔内的Ca2+大量外流入细胞质，通过IP3Rs通路进入线粒体的Ca2+反而减少，从而抑制线粒体通路的细胞凋亡[28]。CVB3感染后，凋亡程序立即在细胞中启动，但在病毒感染的中期，细胞凋亡突然停止，表明细胞凋亡被部分抑制或延迟[25]。2B蛋白抑制线粒体途径的凋亡反应，为病毒基因组的复制提供了所需的时间，保证了病毒的成功复制与繁衍，由此可见，2B蛋白抑制细胞凋亡在CVB3的繁殖性感染中占有主导地位[9,25]。

4.42B蛋白通过抑制细胞凋亡为病毒复制提供时间 2B蛋白的主要功能就是为病毒的复制提供时间。①2B蛋白可导致内质网和高尔基体中的Ca2+水平降低，进而影响内质网与高尔基体产生的囊泡的转运功能，抑制宿主细胞的抗病毒免疫应答；同时，也可导致囊泡积聚在细胞质中，为病毒RNA复制提供场所[6,18]。②2B蛋白可暂时性阻断线粒体凋亡途径，为病毒RNA复制提供时间，但CVB3感染晚期，宿主细胞的凋亡依然会恢复，因此在宿主细胞中会出现成熟的凋亡信号，这是由于线粒体膜的通透性或势能受到破坏，最终导致被感染的细胞死亡，从而使病毒后代能够离开宿主细胞，释放已组装好的病毒，进行下一轮的感染[14,28]。

2B蛋白一方面可激活ERS，引起内质网途径凋亡，另一方面可抑制线粒体途径凋亡，但这两者间的复杂关系目前尚未完全明确。2B蛋白在病毒感染早期可抑制线粒体途径的细胞凋亡，还可破坏Ca2+稳态造成ERS，而长期或过度的ERS可进一步诱导细胞凋亡[6]。在ERS的早期阶段，内质网与线粒体接触的数量增加，以此来调节线粒体的代谢以帮助细胞度过应激状态，因此2B蛋白对内质网与线粒体的不同影响可能在感染时间方面存在差异[7,26]。有研究者在海拉细胞和感染CVB3的小鼠中转染2B蛋白的短发夹RNA，结果发现，2B蛋白的短发夹RNA对海拉细胞中的病毒具有显著的抑制作用，同时小鼠的存活率显著提高、病毒组织的滴度降低、组织损伤减轻[29]。可见，2B蛋白对于宿主细胞更多的是一种负性作用，因此沉默CVB3 2B蛋白的基因是治疗CVB3感染的有效靶点。

5 靶向2B蛋白的潜在治疗方向

目前，针对2B蛋白的治疗思路主要包括：①2B蛋白的基因与结构特点均已明确，因此对其进行特异性标志与检测可作为病毒性心肌炎的一种筛查手段[6]。②在靶向病毒孔蛋白的药物中筛选抗小RNA病毒药物是一种可行的方法，目前有4种类型的病毒孔蛋白抑制剂具有活性，包括金刚烷、阿米洛利、烷基亚胺糖和螺旋胺，但还需进一步的详细调查和药物筛选[6,30]。③对互补信使RNA的特异性降解可被小干扰RNA或折叠的短发夹RNA触发，该技术已应用于多种疾病的治疗及药物研发中[6,29,31]。④2B蛋白是肠道病毒属共有的一类非结构蛋白，因此针对2B蛋白的有效治疗可能扩大抗病毒治疗策略的范围[8,10]。

6 小 结

CVB3感染宿主心肌细胞后，作为一种病毒蛋白2B蛋白可干扰宿主细胞膜的稳定、扰乱细胞器离子稳态、损害细胞正常生理功能，最重要的是其可通过控制宿主细胞凋亡的进程支持病毒生命周期的顺利完成。因此，2B蛋白可作为CVB3心肌炎的一个潜在治疗靶点。虽然目前对2B蛋白的研究相对较少，但2B蛋白疏水性和膜拓扑的多样化以及特殊的Viroporin活性，均可为抗CVB3感染的病毒性心肌炎的干扰治疗提供新思路[6,8,30]。目前2B蛋白在心肌炎细胞凋亡中的作用和具体机制已逐渐清晰，未来可通过对2B蛋白的干扰实现对CVB3感染进程的控制，从而减轻CVB3对病毒性心肌炎患者心肌细胞的直接损伤。