Meesmann角膜上皮营养不良发病机制及治疗的研究进展

薛海娜，王丽媛，郑涛，赵楚楚，张毅，刘含若，刘平

(1.哈尔滨医科大学附属第一医院眼科，哈尔滨 150001； 2.首都医科大学附属北京同仁医院 北京市眼科研究所，北京 100730)

Meesmann角膜上皮营养不良(meesmann epithelial corneal dystrophy，MECD)是一种以上皮含有细小微囊为主要特征的罕见角膜遗传性疾病，主要发生在欧洲地区。MECD发病的最小年龄为6个月，但由于疾病进展缓慢且无显著症状，大部分患者直至青春期才被诊断[1]，因此又称为青少年遗传性MECD。MECD患者主要表现为流泪、畏光、眩光、异物感以及轻度视力下降，严重者可出现反复上皮糜烂，导致角膜出现新生血管并累及角膜前弹力层。1997年，Irvine等[2]发现，角蛋白(keratin，KRT)3基因或KRT12基因错义突变可改变相应KRT3蛋白和KRT12蛋白的结构，导致MECD患者角膜上皮结构的稳固被破坏。目前，MECD的发病机制主要包括内质网应激、未折叠蛋白反应和凋亡[3]。另外，自噬[4]、晶体蛋白[5]等也可能与MECD的发生发展有关，但目前仍存在争议。对于症状轻微的MECD患者，只需对症治疗，而对于症状较重或反复发作的MECD患者目前最有效的治疗方式是角膜移植，但仍有一定的复发率。在体外和动物疾病模型中，小干扰RNA、规律间隔成簇短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated protein 9，cas9)系统均被证实可有效治疗MECD[3,6]。现就MECD发病机制及治疗的研究进展予以综述。

1 MECD的发病机制

1.1个体表型的表现及影响因素 MECD患者在裂隙灯检查下可见微囊性上皮混浊，在逆光照射下可观察到大量透明、细小的微囊分散或局限于眼睑间区并延伸至角膜缘，裂隙灯下也能观察到灰色平行线样改变和无病变区域[7]。透射电镜下发现，MECD患者上皮细胞胞质中含有大小不等的空泡，在空泡中含有一些类似于溶酶体的膜结合体[8]。利用光学相干断层成像检查眼前段发现，除小泡外，慢性炎症患者的角膜上皮层较正常上皮层厚，且上皮细胞中存在高反射性物质[7]。体内激光共聚焦显微镜检查也发现了与光学相干断层成像相似的高反射物质表现[9]。既往研究表明，微囊中角膜上皮的高反射性物质为退行性细胞，而基底膜的高反射性物质为增生的基底膜，类似于上皮基底膜营养不良的病理改变[10]。值得注意的是，虽然MECD主要累及角膜上皮，但其病理改变甚至可影响前弹力层。

MECD的表型可能与氨基酸突变类型相关，如携带KRT12-L132P基因突变的MECD患者的临床症状及病理损害较KRT12-L132H基因突变的MECD患者更严重[3]。KRT12-L132P基因突变的MECD患者角膜含有微囊且上皮纤维化的比例更高，但也并非绝对，相同基因突变的患者在不同地区会出现不同的症状。如1例美国KRT12-L132P基因突变的MECD患者无症状，而部分日本相同基因突变MECD患者则表现为干眼、异物等症状且病理损害更严重[7]。

1.2内质网应激和未折叠蛋白反应 KRT12基因错义突变可破坏内质网稳态，导致未折叠和错误折叠蛋白的积累，最终导致内质网应激和未折叠蛋白反应。有研究在携带KRT12-L132P基因突变的人源化小鼠角膜上皮中观察到KRT聚集，提示KRT12-L132P基因突变是MECD的重要致病因素[3]。未折叠蛋白反应首先通过减少蛋白质的生物合成缓解内质网超载，并上调细胞质分子伴侣蛋白(如热激蛋白)水平，纠正错误折叠，缓解内质网应激[11]。免疫球蛋白重链结合蛋白可结合未折叠蛋白，使底物蛋白保持易折叠的状态。适应性反应通过3个分支系统维持细胞稳态，即蛋白激酶R样内质网激酶、需肌醇酶1、活化转录因子6分别与免疫球蛋白重链结合蛋白解离后活化[12]。蛋白激酶R样内质网激酶和需肌醇酶1为内质网Ⅰ型跨膜糖蛋白，活化转录因子6为内质网Ⅱ型跨膜糖蛋白。蛋白激酶R样内质网激酶通过磷酸化翻译起始因子2α亚单位，使其不能形成翻译起始复合物而抑制蛋白质合成[12]。活化转录因子6可增强内质网分子伴侣编码的转录活性，提高内质网蛋白的转运、折叠和降解能力；需肌醇酶1可帮助底物剪切、编码转录因子并增强脂质合成基因的活性[13]，而高脂肪酸和高胆固醇可使内质网膜腔扩张，最终缓解内质网应激。

由于错误折叠蛋白的持续表达，转录因子CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein，CHOP)在活化转录因子6和蛋白激酶R样内质网激酶的诱导下被激活，导致细胞凋亡[14]。CHOP通过激活一系列凋亡反应蛋白，使磷酸化的翻译起始因子2α亚单位信使RNA去磷酸化，增加蛋白的翻译和合成[12]。CHOP可在内质网中形成过氧化环境或活化胱天蛋白酶(caspase)，caspase-12是内质网应激诱导的特异性细胞凋亡的调节因子，可通过刺激caspase-9而诱导细胞凋亡。研究显示，与野生型小鼠相比，携带KRT12-L132P基因突变的人源化小鼠角膜上皮凋亡标志物CHOP、caspase-12水平均升高；同时，在MECD患者角膜上皮中也发现了CHOP、caspase-12等促凋亡因子[15]。另有研究显示，与野生型小鼠相比，KRT12-L132P基因突变小鼠模型角膜上皮凋亡水平增加了17倍[3]。此外，内质网应激还可促进钙离子释放进入细胞质，导致线粒体钙超载、细胞色素释放，促进凋亡小体形成，最终导致细胞膜破裂和细胞凋亡[16]。

1.3KRT结构的变化 KRT3(Ⅱ型、碱性KRT)和KRT12(Ⅰ型、酸性KRT)为角膜上皮细胞的骨架蛋白，可通过与核膜结合维持表皮的完整性。KRT由N端头部、α-螺旋杆部和C端尾部组成，α-螺旋杆部由4个螺旋片段(即1A、1B、2A和2B)组成，通过非螺旋样结构的连接成分(L1、L12、L2)相互连接，而头部和尾部的非螺旋区域含有大量磷酸化位点[17]。需要注意的是，螺旋起始基序(helix-initiation motif，HIM)和螺旋终止基序(helix-termination motif，HTM)结构保守，HIM和HTM区域的基因突变可引起MECD。研究发现，最常见的KRT12基因突变是p.R135T，且仅在欧洲人中检测到，推测可能与人种差异有关[18]。另有研究表明，p.L132P基因突变导致的临床症状更严重[19]。除p.R84W在头部发生突变外，KRT3中的所有突变均位于KRT3的HTM区域[3]，见表1。

KRT3和KRT12组装成平行二聚体后，将两个平行二聚体的杆部N端半部分重叠形成反向平行的四聚体，随后组装成“60 nm丝”，这些纳米纤维在体外组装形成厚度为10 nm的绳索状纳米丝[36]。

由于KRT3或KRT12基因突变，相应的KRT3或KRT12蛋白结构改变，形成不稳定的平行二聚体，使细胞脆性增加。MECD患者角膜上皮中的KRT6和KRT6a表达上调可减少角质形成细胞的迁移，帮助上皮修复[3]。同时，KRT6还具有抗菌作用，而KRT16作为免疫调节的一员，一般在正常角膜上皮中无表达，但在MECD患者角膜上皮细胞中可观察到KRT16的表达[37]。综上，KRT6和KRT16在应激反应中表达上调，包括紫外线应激、切口愈合和氧化应激。

在胚胎早期，KRT5和KRT14以异源二聚体的形式在基底层、角膜和角膜上皮中表达，随着外周层中KRT12表达的增加，KRT14的表达逐渐减少[38]。相反，在无KRT12的情况下，其他KRT(如KRT14)可上调[5]。稳定的细胞内聚不仅需要KRT中间丝的表达，还需要桥粒与中间丝的相互作用。既往研究发现，KRT5/KRT14(主要是KRT5)支持稳定且高度黏附的桥粒，而KRT6/KRT7则通过减少细胞间黏附增强桥粒的活性[39]。研究显示，与正常角膜相比，MECD患者上皮细胞中的KRT5、KRT14、KRT6和KRT16蛋白丰度均显著增加[3]。以上研究均提示，桥粒并不是MECD主要的致病机制。

1.4晶体蛋白在MECD中的作用 晶体蛋白是晶状体的主要蛋白，可保持晶状体的透明度。α晶体蛋白对晶状体的细胞质具有保护作用，包括抑制细胞凋亡、增强晶状体细胞的抗应激性、维持细胞骨架的完整性等；当视网膜上皮细胞发生严重应激时，细胞内的β晶体蛋白、γ晶体蛋白也具有保护作用，其既可保护视网膜细胞，又可抑制细胞凋亡[40]。因此，晶体蛋白在抑制角膜上皮细胞凋亡方面具有重要意义。同时，晶体蛋白与细胞骨架的相互作用可以防止中间丝的异常聚集。因此，与小热激蛋白一样，晶体蛋白在角膜上皮中作为分子伴侣识别变性蛋白，并主动与变性蛋白结合形成小热激蛋白底物复合物，阻止变性蛋白的积累[41]。在KRT12-L132P基因突变的纯合子小鼠模型的角膜上皮细胞中也发现了晶体蛋白基因的上调[3]，但具体作用机制仍需进一步探索。综上可知，晶体蛋白对MECD也有保护作用，不仅可防止异常的蛋白质堆积，还可抑制MECD患者角膜上皮细胞凋亡。

1.5自噬 自噬是一种主要的细胞内降解系统，可将非天然蛋白(如错误折叠蛋白)放置在蛋白酶体和溶酶体的腔室中进行降解[42]。自噬参与多种由KRT基因突变引起的疾病，如年龄相关性黄斑变性。KRT8可促进年龄相关性黄斑变性模型视网膜色素上皮细胞氧化应激后自噬体和溶酶体的融合[4]。同样，KRT5的自噬作用对于正常的包皮腺体分化也至关重要[43]。另外，KRT18的自噬作用也被证实[43]。共聚焦检查发现，MECD患者角膜上皮可见溶酶体样空泡，病理上可见胞质内囊样包涵体[44]。由于KRT的异常聚集，包裹体被蛋白酶体降解形成溶酶体样空泡。自噬异常也是包涵体形成的原因之一。

2 治 疗

目前MECD尚无有效的临床药物治疗，若患者症状轻微(如畏光、流泪、眼干、异物感以及角膜上皮点状缺损)只需对症治疗，如利用人工泪液、护目镜、睫状肌麻痹剂、角膜绷带镜等缓解症状。对于症状严重或反复发作的患者则需手术治疗。目前的手术方式主要包括激光消融和角膜移植，但术后仍可能复发。

2.1激光消融治疗 携带KRT12-L132P基因突变的MECD患者可出现复发性角膜上皮侵蚀和上皮下纤维化等严重症状，需要行上皮清创术、准分子激光治疗性角膜切削术[3]等，其中准分子激光治疗性角膜切削术是首选的治疗方式。准分子激光治疗性角膜切削术可有效去除角膜上皮或前弹力层的病变区域，局部丝裂霉素C与准分子激光治疗性角膜切削术联合治疗可降低MECD患者的复发率[45-46]，但联合治疗后仍可能复发。如1例34岁女性MECD患者接受激光治疗性角膜切削术后3个月角膜上皮微囊再次出现，且1年后出现视力下降[47]。另外，1例 33岁的白人男性MECD患者在接受激光治疗性角膜切削术联合丝裂霉素C治疗后也出现了复发且视力下降[1]。

2.2角膜移植手术治疗 随着科技的进步和手术方式的改进，角膜移植已不再是首选治疗方式。但对于症状严重且反复发作的MECD患者，板层角膜移植或穿透性角膜移植仍是最有效的治疗方式[3]。穿透性角膜移植虽然是MECD最有效的治疗方式，但角膜排异导致其风险增大，无法达到良好的预后效果。板层角膜移植术是近年的主流术式，主要优点为创伤小，可以替换病变角膜上皮及前弹力层，且对角膜内皮的影响较小，因此并发症及术后的风险相对较低，术后恢复快。但也有研究报道了MECD患者出现板层角膜移植术后复发或穿透性角膜移植术后复发的案例[2,47]。

2.3基因治疗 目前关于MECD的治疗研究主要集中于稳定角膜上皮的小分子疗法方面。一项应用小干扰RNA治疗KRT12基因突变小鼠模型的研究显示，小干扰RNA治疗的一个严重不良反应为脱靶效应，虽然可最小化MECD小鼠模型不必要的脱靶效应，但未来还需在临床试验中对患者是否存在脱靶效应进行全面评估[19]。CRISPR是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御系统，可有效防止病毒或质粒DNA的入侵，CRISPR/cas9技术是目前医疗领域中最先进的基因编辑方式，可通过靶向基因修饰矫正疾病基因的突变[6]。Courtney等[48]发现，在MECD患者的角膜中，KRT12-L132P基因突变可产生一个新的原间隔序列邻近基序，为研究者提供了可设计的向导RNA与原间隔序列邻近基序的相邻序列互补，最终使致病基因不再表达；另外，CRISPR/cas9技术不仅在体外细胞中可显著降低致病基因相关蛋白的表达，在携带KRT12-L132P基因的小鼠模型中也可观察到KRT12-L132P基因内的移码缺失，为显性错义突变的治疗提供了新方向。

3 小 结

由于KRT12基因中的杂合突变导致KRT蛋白不能折叠成正确的二级或三级结构，错误折叠蛋白质沉积在内质网中，引起内质网应激，继而引起未折叠蛋白反应缓解应激状态。此外，自噬和一些KRT上调也可帮助蛋白质正确折叠来缓解应激状态。然而,未折叠蛋白反应时间过长会进一步加重内质网应激,最终导致细胞凋亡，形成微囊。当细胞微囊向上移动、破裂并形成上皮点状缺损时，常被误诊为干眼的症状。此外,微囊的形成可能是由异常的平行二聚体增加了细胞脆性，使上皮细胞无法抵抗机械应力所致。未折叠蛋白反应和细胞凋亡机制仍需进一步验证，包括晶体蛋白和自噬的作用以及KRT的改变等。未来基因治疗前景广阔，但仍需大量研究验证。