基于网络药理学和分子对接探析健脾丸治疗慢性胃炎的作用机制

卢启明，胡小英

1.广州中医药大学第一临床医学院，广东广州 510405；2.广州中医药大学第一附属医院儿科，广东广州 510405

前言

慢性胃炎是有害因子长期反复作用于胃黏膜引起损伤的结果［1］，随着年龄的增加，慢性胃炎的患病率逐渐上升［2］，目前，我国基于内镜诊断的慢性胃炎患病率接近90%［3］。慢性胃炎属于中医“胃痛”、“痞满”、“呃逆”等范畴［4］，中医治疗慢性胃炎有一定的疗效［5-9］，临床上具有广阔的前景。健脾丸出自《医方集解》中“消导之剂”，由白术、陈皮、麦芽、山楂、太子参、枳实组成，具有健脾和胃，消积导滞之功，主治“脾虚血弱、饮食不消”。在临床上运用此方进行加减治疗慢性胃炎具有较好疗效［10］，然而其作用机制尚不明确，且传统的研究方法难以全面阐述中药通过多成分、多靶点、多途径治疗疾病的作用机制。本研究拟通过网络药理学及分子对接技术分析健脾丸治疗慢性胃炎的作用机制，为临床应用提供依据并为后期实验及临床研究提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 健脾丸药物的成分筛选及靶点预测

本研究首先通过中药系统药理学技术平台（TCMSP）（http://tcmspw. com/tcmsp. php）以“Herb name”为检索词分别检索白术、陈皮、麦芽、太子参、枳实的有效化学成分。根据成分毒药动力学（ADME）中的参数进行筛选，以口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%，药物相似性（Drug Likeness, DL）≥0.18 为基准，筛选出对应中药材的主要活性成分，并对主要活性成分进行靶蛋白预测，通过Universal Protein 数据库（UniProt）（https://www.uniprot.org/）将靶蛋白转换成与之对应的靶基因。通过化学专业数据库［11］（http://www.organchem.csdb.cn/scdb/default.asp）检索与山楂相关的化学成分，利用其CAS 号在PubChem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载结构文件，将对应的结构文件导入SwissADME平台（http://www.swissadme.ch/）并运行，根据成分毒药动力学参数进行筛选，以Pharmacokinetics 中GI absorption 结果为High，并且Druglikeness 中的 Ghose、Egan、Veber、Lipinski、Muegge 存在3 项或以上结果为“Yes”作为基准，筛选出关于健脾丸组方之一的山楂的主要活性成分，在SwissTargetPrediction平台（http://www.swisstargetprediction.ch/）中导入结构文件进行靶点预测。最后将配对好的成分、靶基因一起导入Cytoscape（3.7.2）软件中，构建健脾丸成分-靶点网络并进行分析。

1.2 慢性胃炎靶标基因的检索

在GeneCards 数据库（https://www. genecards.org/）中输入“chronic gastritis”作为关键词进行检索，选择“export to excel”选项将靶标基因导出为Excel格式，选取Relevance score≥中位数的靶标基因，获得慢性胃炎的主要靶标基因。

1.3 构建PPI网络

将健脾丸的靶基因导入STRING 平台（https://string-db.org/），构建健脾丸各个靶点间相互作用的网络关系图（Protein Protein Interaction network，PPI network）。将慢性胃炎的靶标基因导入STRING 平台，构建慢性胃炎靶点PPI network。将健脾丸和慢性胃炎的PPI network 导入Cytoscape 软件处理分析并取交集，得到健脾丸治疗慢性胃炎核心靶点的PPI network。

1.4 KEGG 通路的富集分析以及构建成分-靶点-通路网络系统

将筛选出来的健脾丸的核心靶点导入Metascape平台（https://metascape.org/），选择KEGG 富集分析（P<0.01），结合相关文献，选择与慢性胃炎可能存在联系的通路，将存在关联性的成分以及靶点一起导入Cytoscape 软件中，构建出健脾丸治疗慢性胃炎的成分-靶点-通路网络系统。

1.5 分子对接

利用Cytoscape 软件对健脾丸的成分-靶点网络进行分析，从而筛选出其中的关键活性成分，利用PubChem 数据库下载化合物3D 结构文件，通过Openbable 软件将其转化为.pdb 格式，未能检索到相应3D 结构的活性成分则依据2D 结构，利用ChemDraw 软件得到对应的3D 结构，通过PDB 数据库（https://www.rcsb.org/）下载已验证的与慢性胃炎相关的BBC3、IL-17A［12-15］的蛋白结构，导入分子对接软件Autodock Vina 中，操作健脾丸关键活性成分的结构分子与BBC3、IL-17A 分子对接，得到多个构象，将其中结合能绝对值最高的构象导入Pymol 软件中进行可视化分析。

2 结果

2.1 健脾丸成分-靶点网络

通过TCMSP 数据平台、化学专业数据库及SwissADME 平台筛选出健脾丸的主要成分，通过UniProt 数据库及SwissTargetPrediction 平台对主要成分进行靶点预测，剔除冗余的成分，得到主要活性成分共56 个，见表1。将成分、靶基因导入Cytoscape软件，构建健脾丸成分-靶点网络，见图1，通过Cytoscape 软件对健脾丸成分-靶点网络进行分析，该网络中共有465个节点，1 090条边，以Degree≥6倍中位数，筛选出共健脾丸的7 种关键活性成分，分别是12-senecioyl-2E,8E,10E-atractylentriol、Obacunone（黄柏酮）、quercetin（槲皮素）、epicatechin（表儿茶素）、luteolin( 木犀草素)、naringenin（柚皮素）、betasitosterol（beta-谷甾醇）。

图1 健脾丸成分-靶点网络图Fig.1 Component-target network diagram of Jianpiwan

表1 健脾丸主要活性成分Tab.1 Main active components of Jianpiwan

2.2 慢性胃炎靶标基因及数据处理

通过GeneCards 数据库检索“chronic gastritis”，共检索到1 095 个靶点，根据“Relevance score”进行排序，以Relevance score≥中位数选取靶标基因共553个，部分基因见表2。

表2 慢性胃炎部分基因Tab.2 Partial genes of chronic gastritis

2.3 构建PPI网络，筛选核心靶点

通过STRING 平台分别构建健脾丸靶点PPI network 和慢性胃炎靶标基因PPI network，导入Cytoscape 软件利用“Merge”功能对两个PPI network取交集，得到健脾丸治疗慢性胃炎核心靶点的PPI network 并进行分析，慢性胃炎核心靶点的PPI network 中共有节点88 个，边1 372 条，见图2。图中靶点由小到大表示Degree 值由小变大，即该靶点与其他靶点相互作用的机会越多，边由细到粗表示Combined score 由小变大，即靶点间的相互作用关系越强。

图2 健脾丸治疗慢性胃炎核心靶点Fig.2 Core targets of Jianpiwan in treating chronic gastritis

2.4 KEGG通路富集分析及构建成分-靶点-通路网络

运用Metascape 网络平台对健脾丸治疗慢性胃炎的88 个核心靶点进行KEGG 富集分析，得到KEGG 相关通路共295 条，经查阅文献，与慢性胃炎相关的通路主要有17 条，使用微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/）富集气泡图对17 条主要通路进行数据处理，得到图3，图中纵轴代表KEGG 分析的通路，横轴代表每个通路的富集程度，点的大小代表88 个核心靶点中富集到该通路的靶点个数，点的颜色由绿色到红色代表P值由大到小。经查阅相关文献，健脾丸治疗慢性胃炎的关键信号通路主要是细胞凋亡信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、C 型凝集素受体信号通路、PI3K-Akt 信号通路、IL-17 信号通路、TNF 信号通路、JAK-STAT 信号通路、MAPK 信号通路、幽门螺杆菌感染中的上皮细胞信号传导、Th17细胞分化，提示健脾丸是通过多个信号通路而起到治疗慢性胃炎的效果，这也体现了中医治疗疾病的整体观念。将筛选出的7 种关键活性成分、10 条关键信号通路及这些通路上的关键靶点导入Cytoscape软件中构建健脾丸治疗慢性胃炎的关键成分-靶点-通路网络，见图4。

图3 KEGG富集气泡图Fig.3 KEGG enrichment bubble diagram

图4 健脾丸治疗慢性胃炎的关键成分-靶点-通路网络图Fig.4 Key component-target-pathway network diagram of Jianpiwan in treating chronic gastritis

2.5 分子对接

利用PubChem 数据库下载健脾丸Obacunone（黄柏酮）、quercetin（槲皮素）、epicatechin（表儿茶素）、luteolin（木犀草素）、naringenin（柚皮素）、betasitosterol（beta- 谷甾醇）的化合物结构，使用Openbable 软件将化合物结构信息转化为.pdb 格式，利用ChemDraw 软件画出12-senecioyl-2E,8E,10Eatractylentriol的结构，以.pdb 格式输出。将关键活性成分的蛋白结构与BBC3、IL-17A 的蛋白结构导入Autodock Vina 软件进行分子对接，将结合能绝对值最高的构象导入Pymol软件进行可视化分析，结果见表3和图5。图5中紫色条状物为蛋白质，绿色棍状物为关键活性成分，浅蓝色棍状物为蛋白质与关键活性成分相结合的结构，黄色虚线为结合键，深蓝色球状物为水分子。

图5 健脾丸部分关键活性成分与BBC3、IL-17A分子对接图Fig.5 Molecular docking diagram of some core active components of Jianpiwan with BBC3 and IL-17A

表3 健脾丸关键活性成分与BBC3、IL-17A分子对接结合能（kcal∙mol-1）Tab.3 Molecular docking binding energy of core active components of Jianpiwan with BBC3 and IL-17A(kcal∙mol-1)

3 讨论

本研究根据网络药理学理论及分子对接技术，联合多个数据库，利用数据分析、高通量筛选、生物网络构建、网络拓扑结构分析等技术，对健脾丸治疗慢性胃炎多成分、多靶点、多途径进行科学有效的预测及分析，探讨健脾丸治疗慢性胃炎的作用机制。

根据健脾丸成分-靶点网络，健脾丸的主要活性成分共 56 个，其中 12-senecioyl-2E, 8E, 10Eatractylentriol、Obacunone（黄柏酮）、quercetin（槲皮素）、epicatechin（表儿茶素）、luteolin（木犀草素）、naringenin（柚皮素）、beta-sitosterol（beta-谷甾醇）的Degree 值最高，并且通过分子对接技术，均对慢性胃炎发生发展过程中的关键蛋白具有较好的亲和力。其中，木犀草素、柚皮素、黄柏酮、槲皮素、beta-谷甾醇均可通过多个通路促进细胞凋亡，能够不同程度地抑制慢性胃炎的进展，特别是慢性萎缩性胃炎向胃癌的进一步恶化，并且可以通过多个途径抑制癌细胞［16-22］。如Pu 等［23］和Lu 等［24］通过研究发现在胃癌细胞中木草犀素可以通过AKT、ERK、P13K 和p38等多个信号通路，调节一系列miRNAs 表达，表明其具有作为人类胃癌治疗药物的潜力。有研究指出黄柏酮和柚皮素还具有抗炎作用，并且柚皮素还能在一定程度上缓解炎症引起的疼痛，另外，黄柏酮还具有调节消化道微生物群的作用，并能抵抗某些消化道病毒［25-28］。槲皮素除了可以调节胃细胞的增殖和凋亡的平衡，还可以保护胃上皮细胞免受氯化物的损伤并调节胃平滑肌舒张功能，因此在治疗慢性胃炎和功能性胃消化不良及其他轻微胃肌肉运动障碍方面均具有潜在的价值［29-30］。Rozza等［31］通过研究发现表儿茶素可以加强胃黏膜屏障，并能一定程度地中和胃液，从而起到保护胃黏膜的作用。

在健脾丸治疗慢性胃炎核心靶点PPI network中，Degree 值最高的3 个靶点分别是IL-6、VEGFA、TP53，为潜在的关键核心靶点。IL-6 是机体炎症反应急性期的诱导成分之一，对B细胞的分化以及辅助T 细胞的发育均必不可少［32］。在幽门螺旋杆菌感染的慢性胃炎患者中，机体受到幽门螺旋杆菌的刺激后可促使IL-6 基因表达，并且其表达水平与慢性胃炎的分级具有相关性［33-34］。VEGFA 是一种具有重要促血管生成活性的因子，通过维护血管内皮细胞的形态，可调节血管内皮张力，维持血管的正常功能［35］。VEGFA 具有诱导内皮细胞增殖、促进细胞迁移、抑制细胞凋亡等作用。陈聪英等［36］通过研究发现VEGFA 在健康人、胃炎患者、胃溃疡患者和胃癌患者的阳性表达率分别为37.6%、52.38%、78.33%、90.38%（P<0.05），可见VEGFA 的表达水与胃相关疾病的进展具有较大的相关性。TP53分子是迄今为止在人体内发现的最重要的抑癌基因，根据机体的生理情况而产生不同功能。当细胞处于正常状态时，TP53蛋白不干扰正常细胞运行；当细胞受损时，TP53蛋白降解被阻断，TP53水平升高，迅速激活并启动对细胞的修复功能；当细胞DNA 损伤严重而不能完全修复时，TP53 蛋白将抑制细胞生长，促使其凋亡［37］。有报道指出在胃癌发展早期，TP53的改变就发生了，甚至可能在非肿瘤性黏膜病变中也存在，并且其改变的频率随着疾病进展逐渐增加［38］。

通过富集分析及查阅相关文献，健脾丸治疗慢性胃炎的关键信号通路主要有细胞凋亡信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE 信号通路、C 型凝集素受体信号通路等多个通路。其中，细胞凋亡信号通路排第一。细胞凋亡是一个高度调节的死亡过程［39］，通过基因编程消除受损或多余的细胞，以获得更大利益，是在多细胞生物中常规进行的正常生理过程［40］。细胞凋亡是细胞死亡的信号通过多个途径传递，最终促使负责细胞坏死的半胱天冬酶激活而发挥作用［41］。慢性萎缩性胃炎的发展过程中就会出现细胞凋亡的显著增加，由Fas 和Fas 配体相互作用引起胃腺细胞凋亡［42］。也有报道指出，IL-17A 在此过程中起主要作用，促进胃壁细胞的凋亡进而引起胃黏膜的萎缩［43］。研究显示在正常的胃黏膜中，被覆上皮和腺上皮仅检测到少量的凋亡细胞，而在幽门螺旋杆菌胃炎的胃窦和胃体的被覆上皮以及胃窦的腺上皮中凋亡细胞的数量明显增高，在其胃体的腺上皮中，凋亡细胞的数量再次增加［44］，这说明胃黏膜细胞的缺失与细胞凋亡有密切联系。糖尿病并发症中的AGE-RAGE 信号传导涉及NADPH 氧化酶、蛋白激酶C 和MAPK 等多个细胞内信号途经的激活，从而促使NF-κB 激活。有研究指出将年龄作为一个因素，可能通过AGE/RAGE/NF-κB 通路下调平滑肌收缩蛋白的表达，从而导致胃动力障碍［45］。C型凝集素受体信号通路是由C 型凝集素受体介导的信号通路，C 型凝集素受体是一个大型蛋白质家族，当其与配体结合后，刺激细胞内的信号传导级联反应，从而诱导炎性细胞因子及趋化因子产生，介导先天性及适应性免疫。但在幽门螺旋杆菌感染患者中，幽门螺旋杆菌的代谢产物可以通过C 型凝集素受体信号通路进一步加重胃炎［46］。此外，通过KEGG 富集分析还提示PI3K-Akt 信号通路、IL-17 信号通路、TNF 信号通路、JAK-STAT 信号通路等多个通路均与慢性胃炎有一定联系，这也体现了中医是从整体观出发，通过多个途径而达到治病的目的。

本研究通过网络药理学和分子对接技术对健脾丸治疗慢性胃炎的多个成分、多个靶点、多条通路及其之间的相互关系及作用进行分析，然而考虑到本研究主要依托网络数据库信息，并且研究过程中尚未考虑到药物的剂量、剂型、煎煮、服用方法等问题，本研究仍处于理论探讨水平，需进一步行实验室和临床试验进一步论证。