程序性坏死在心脑血管疾病及肿瘤发生中的作用及研究进展

刘星宇，张共鹏，魏艳龙，高 琴

程序性坏死(necroptosis)是继细胞凋亡、坏死和自噬后被新发现的一种新的细胞死亡方式，主要表现为典型的坏死样形态。但与坏死相比，其过程受到一系列蛋白的精确调控。经典的necroptosis需要由起始因子介导，随即形成RIP1-RIP3-MLKL死亡复合体，同时发现存在由RIP3-CaMKⅡ通路介导的新通路。Necroptosis与多种心脑血管疾病及肿瘤的发生有关，若能对其调控方式进行抑制或阻断可缓解相关疾病的发生，将为药品开发及临床治疗提供新思路。

1 Necroptosis概述

通常认为，细胞的死亡包括三种形式，即细胞凋亡、细胞坏死和细胞自噬。但近年来，随着生物医学领域的发展，一种新的细胞死亡方式被发现，即necroptosis。Necroptosis首次由DEGTEREV等[1]报道，他们通过研究肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)和Caspase抑制剂zVAD-fmk处理的包括U937细胞在内的多种细胞模型，发现Fas/TNFR受体家族在触发典型的凋亡通路的同时激活了非凋亡的死亡途径，并且筛选出一种可以阻碍这种坏死发生的小分子抑制剂。Necroptosis的特征介于细胞凋亡和细胞坏死之间：形态学上表现为具有凋亡和坏死的混合性特征，即细胞核凝聚、细胞膜丧失、线粒体肿胀等；细胞反应上表现为自噬清除细胞残骸。但在生化特征上，如DNA是否降解，DNA核小体间是否断裂等尚不明确[2]。Necroptosis通路的具体机制目前尚不明确，但研究[3]表明，其最主要的发生途径之一是“死亡受体-受体交互作用蛋白(RIPs)-线粒体-氧自由基通路”，该通路需要多种蛋白及因子参与。

2 RIPs家族成员的结构特点

RIPs是一类具有高度保守丝氨酸和苏氨酸激酶结构域的蛋白质家族，目前已发现的成员有7个，即RIP(RIP1)、RIP2(RICK/CARDIAK)、RIP3(RIPK3)、RIP4(DIK/PKK)、RIP5(SgK288)、RIP6(LRRK1)和RIP7(LRRK2)。这些RIPs家族成员有的介导激活转录因子，有的参与细胞死亡信号的转导。7种蛋白质最显著的共同特征都具有类似的激酶结构域(kinase domain，KD)，其中RIP1～RIP5的KD都在靠近N端的位置。除此之外，RIP1还有一个C端的死亡结构域(death domain，DD)和包含在中间结构域(intermediate domain，ID)中的一个同源结构基序(homotypic interaction motif，RHIM)。RIP2有一个Caspase激活募集区。RIP3也具有RHIM，但缺少C端的DD和桥梁结构ID。RIP1和RIP3共同具有的RHIM具有极其重要的意义，在necroptosis通路中起关键作用。RIP4和RIP5有着共同的ID和C端锚定蛋白结构域。RIP4主要存在于角质细胞细胞质中，参与NF-κB通路的转导。RIP6和RIP7在结构上与其他家族蛋白差异较大，除去共有的KD外，还有许多特异性的结构，如富含亮氨酸的重复区域，但它们的作用尚不明确，可能与帕金森综合征有关联[4-6]。

3 经典的necroptosis通路

已知的经典的necroptosis起始因子不止一种，暂不确定它们是否具有共同的下游信号通路。这类因子主要包括Toll样受体家族、模式识别受体和死亡受体(death receptor,DR)家族。其中DR家族主要有肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor,TNFR)、Fas蛋白和肿瘤坏死因子相关凋亡诱生配基(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)受体[7-8]。目前，针对TNF-α/TNFR诱导的通路研究较多。当TNF-α与其受体识别并结合，TNFR迅速活化，形成聚合体。TNFR可以与RIP1的DD部分直接结合，而Fas和TRAIL受体则需要借助Fas相关死亡结构域(FADD)来连接。此外，TNF受体相关结构域(tumor necrosis factor receptor- 1-associated death domain，TRADD)也通过DD部分与TNFR1结合，TRADD又可以募集FADD。多种死亡受体与RIP1结合形成了复合体Ⅰ(NecrosomeⅠ)。随后，胞质中的RIP3通过与RIP1共有的RHM与NecrosomeⅠ结合，使RIP1发生磷酸化，在刺激因子作用下RIP3的Thr231和Ser232位点也发生自磷酸化形成复合体Ⅱ(NecrosomeⅡ)。FADD可以募集Caspase-8，使其自我活化，促进凋亡的进行，同时还能降解RIP1和RIP3，抑制necroptosis的发生，诱导经典的外源性Caspase依赖性凋亡途径。当使用一些抑制剂，如zVAD-fmk来阻滞Caspase-8通路时[9]，RIP1和RIP3则快速聚集，形成大量的NecrosomeⅡ。通过其KD部位的自磷酸化，一方面稳定复合体Ⅱ的结构，另一方面活化RIP3的功能。RIP3作用于一系列靶蛋白来促进细胞走向死亡。已经研究的比较广泛的糖原磷酸化酶、谷氨酸氨基连接酶和谷氨酸脱氢酶1等参与氧化呼吸链和三羧酸循环。RIP3能过度激活它们的功能，使其迅速产生高浓度的氧自由基，破坏内膜系统，引发细胞坏死[6，10-12]。

4 Necroptosis在疾病中的研究进展

4.1 Necroptosis与肿瘤的研究进展 Necroptosis与多种临床疾病都可能有着潜在的联系。目前热门研究方向之一是肿瘤防治。RIP1可以通过参与RIP1-NF-κB/AP-1-VEGF-C信号通路来促进胆囊癌淋巴的转移。同时RIP1还可能促进了胆囊癌细胞株的增殖及侵袭。NF-κB和AP-1转录因子是RIP1激活VEGF-C基因启动子的调控开关。另有研究者评估了RIP1在乳腺癌癌组织和癌旁组织中的表达水平，发现癌组织中RIP1的表达明显高于癌旁组织，且癌组织中RIP1的表达与乳腺癌的分期、分级、有无淋巴结转移呈正相关，从而发现RIP1表达增高与乳腺癌恶性程度较高有关。该研究组还发现RIP1参与食管鳞癌的发生发展，可能起促进癌细胞增殖的作用。紫草素诱导RIP-1高表达可诱导胶质瘤细胞程序性坏死，通过抑制过程中产生的ROS能够明显抑制necroptosis的发生。若用奥沙利铂(L-OHP)直接作用于口腔癌细胞，细胞凋亡率较低，若用siRNA转染来沉默RIP1后,RIP1表达明显下降，细胞的凋亡率有所上升,沉默RIP1并合用L-OHP进行刺激,细胞的凋亡率明显高于单用L-OHP组，提示抑制RIP1的表达可以增强L-OHP诱导口腔癌细胞的凋亡[13-17]。

4.2 Necroptosis与心脑血管疾病的研究进展 Necroptosis另一极具前景的研究方向为心脑血管疾病。早期研究[18]表明，在Fas缺失的细胞突变体中，心肌梗死面积下降显著，过度表达的TNF-α或TRAF2可通过限制心肌缺血来减少由心肌缺血/再灌注引起的损伤。在小鼠中，RIP3的缺乏或CaMKⅡ的抑制对经缺血/再灌注或阿霉素处理过的心肌细胞程序性坏死或心脏衰竭有良好的保护作用。RIP3通过氧化磷酸化来激活CaMKⅡ，进而使线粒体膜通透性增强诱发坏死。RIP3-CaMKⅡ信号通路还同时参与心肌细胞的凋亡和炎症过程[19]。另有研究[20]通过利用Nec-1抑制RIP1-RIP3复合物的形成，对创伤失血性休克大鼠肝脏缺血再灌注损伤产生了保护作用。RIP1激酶(RIP1K)参与了体内短暂性大脑中动脉阻塞和体外氧糖剥夺再灌注诱导的星形胶质细胞增生以及胶质瘢痕的形成。通过Nec-1使RIP1K基因沉默可以抑制星形胶质细胞增生以及胶质瘢痕的形成，最终促进缺血性脑中风后期的神经功能的恢复[21]。

5 展望

近年来，随着学界对necroptosis的认识不断加深，研究思路也不断开阔。在经典的necroptosis中除了RIP1、RIP3外还发现了一些其他的重要关键因子。Necrosome中存在着一个核心组分：混合系列蛋白激酶样结构域(mixed lineage kinase domain-like，MLKL)。MLKL是RIP3的特异性底物，在细胞程序性坏死被启动后参与RIP3的磷酸化，即可激活necroptosis通路。另外，MLKL被磷酸化，暴露出其激酶结构域，使其从单体状态转变为多聚体状态。多聚的MLKL能够结合磷酸肌醇和心肌磷脂，从而由细胞质转移到细胞膜和各细胞器膜上。随后在这些膜结构中形成通透性孔道，破坏膜的完整性，引起细胞坏死。没有MLKL的参与，necrosome将会被抑制在前体阶段。MLKL的磷酸化是细胞程序性坏死通路中不可或缺步骤，但其缺陷对凋亡途径影响不明显[22]。 另外，复合物中的组分之一包括一种线粒体蛋白磷酸酶PGAM5。当necrosome与PGAM5通过MLKL相连后，PGAM5被磷酸化而激活。活化的PGAM5再激活线粒体上动力相关蛋白1导致成串排列的线粒体发生线性断裂，这一现象在细胞坏死发生的早期起到了非常重要的作用[23-24]。

总之，经典的necroptosis是由一系列因子介导的，在Caspase-8受到抑制的条件下形成由RIP1、RIP3、MLKL、PGAM5等组成的复合体，来完成对细胞坏死诱导。但其破坏细胞并致使细胞坏死的具体机制尤其是下游信号通路尚不明确。而对与心血管疾病有关的RIP3-CaMKII通路介导的、不依赖于经典necrosome的程序性坏死的研究也刚刚起步，其具体机制尚不明确。对necroptosis研究的不断深入，进一步揭示其作用的分子机制，将为necroptosis相关的多种疾病的治疗提供新的药物靶点，为临床治疗提供新的思路。