分子育种技术在水貂毛绒品质性状相关基因中的应用进展

刘琳玲，宋姗姗，宋兴超，王桂武※，张如，丛波

（1.中国农业科学院特产研究所农业农村部特种经济动物遗传育种与繁殖重点实验室；吉林省特种经济生物学省部共建国家重点实验室，吉林 长春 130112；2.铜仁学院，贵州 铜仁 554300）

FAO曾预测，21世纪80%的生物育种将依赖分子育种[1]。当前，分子标记辅助选择（marker assisted selection,MAS）是最主要的动物分子育种手段，通过找到与目标性状相关基因紧密连锁的分子标记，分析其基因型，进而对该物种相关性状进行遗传改良[2]。分子辅助育种可以高效筛查与质量性状相关的基因组区域（quantitative trait locus,QTL），采用多态DNA标记绘制遗传图谱，如微卫星和单核苷酸多态性（single nucleotidepolymorphism,SNP）[3]，筛查得到的变异位点，将其与个体质量性状进行关联分析，得到的结果可以加速育种进程，使优良个体被快速识别[4]。

水貂是极其珍贵的毛皮动物，被毛颜色是其貂皮价值最重要的指标。宋兴超[5]对黑色、白色和灰色被毛表型的水貂皮肤样本进行转录组序列测定，结果找到17个参与水貂被毛色素沉积过程的差异表达基因。动物毛色主要由真黑色素与褐黑色素的合成比例、数量及其在毛皮质和髓质中沉积的种类与数量不同所决定且由这些基因共同调控[6]。

水貂皮被称为“裘皮之王”，其特点是绒毛非常丰厚且轻柔结实[7]。目前，对于水貂毛绒品质的性能测定主要有两种方式，一种是皮张分等与分级；另一种是活体打分。皮张的分等与分级是指送到拍卖行，依据已定的质量标准进行等级分类，根据皮张外部质量和特点归类。活体的性能测定主要包括体长、清晰度、光泽度、毛密度、针毛覆盖率和整体毛绒质量。在水貂育种中，与活体毛皮等级及干皮品质相关的性状均处于强选择状态[8]。最新研究发现这些毛绒品质相关性状的遗传力为0.06～0.30[8]。另一项研究报道了这些相关性状的遗传力为0.15～0.43[9]，由于水貂毛绒品质相关性状的遗传选择力较大，即变异系数较大，因此可以通过个体选育进行选择。在传统的水貂养殖过程中，生产群体的亲本是根据毛皮质量来选择的，而经济回报的多少则取决于干皮品质的高低[8]。因此，有必要对活体动物的性状（如体重和体长）和毛皮品质性状进行研究。本研究综述分子育种技术在水貂毛绒品质性状相关基因中的应用，以期为进一步加快高毛绒品质的优良水貂品种的选育提供理论依据。

1 分子育种技术在水貂毛色性状相关基因中的应用

动物被毛颜色已成为一种重要的育种性状。1931年首次报道水貂毛色突变体，其为孟德尔常染色体隐性遗传，特征毛皮颜色为银蓝色[10，11]。此外，大量研究发现与被毛颜色相关的功能基因，包括黑素皮质激素受体-1（melanocortin 1 receptor,MC1R）基因、酪氨酸酶（tyrosinase,TYR）基因、酪氨酸酶相关蛋白1（tyrosinase-related protein 1,TYRP1）基因、刺鼠信号蛋白（agouti signaling protein,ASIP）基因、黑素亲和素（melanophilin,MLPH）基因和小眼畸形相关转录因子（microphthalmia associtated transcription factor,MITF）基因。

MC1R是G蛋白偶联受体（Gprotein-coupled receptor,GPCR）家族最小的受体，在色素合成过程中起开关作用，能与-黑色素细胞刺激素（-MSH）结合，最终活化酪氨酸激酶[12，13]，通过调控真黑色素与褐黑色素的浓度比例，使动物毛色分别表现出黑色、棕色、红色和黄色[10]。宋兴超[5]采用PCR扩增和Sanger测序技术检测水貂MC1R基因编码区和非编码区SNPs，发现该基因编码区上游存在1个缺失突变g.132_135 delAGTG，其突变基因型在金州黑水貂、吉林白水貂、银蓝水貂和咖啡水貂4种毛色群体中差异极显著（P＜0.0001）。推测该位点可能与水貂毛色表型具有相关性，其中银蓝水貂中突变杂合体的基因型频率最高，说明该突变位点可能影响银蓝水貂被毛颜色的主控位点。

TYR蛋白由调控白化位点（Albino）的酪氨酸酶基因编码，它在动物体黑色素合成过程中起关键作用，其表达量和活性直接影响黑色素生成的速度和产量，因此该基因的变异可影响动物毛色性状[14,15]。Anistoroaei等[16]推断，在TYR基因的外显子1中发现一处无义突变（138TGT→TGA），可能与丹麦水貂白化表型的产生具有相关性；Benkel等[17]在TYR基因外显子4中发现1个SNPs，c.1835C＞G位点与喜马拉雅水貂被毛的大理石花纹形成相关；Blaszczyk等[18]研究发现TYR基因外显子1的一处无义突变使编码半胱氨酸的密码子TGT变为终止子TGA，这一变异与美洲水貂白化相关。邢思远[19]采用Sanger直接测序法在红眼白水貂、美国短毛黑水貂和银蓝水貂TYR外显子1中发现1个变异位点，c.78A＞T颠换与白色水貂毛色差异极显著（P＜0.001)，TYR基因外显子1中有1个SNPs（g.138TA）为无义突变，与吉林白水貂表型相关。这几项研究结果一致，得出该基因的突变与水貂毛色的白化相关。宋兴超等[20]采用PCRRFLP技术筛查不同被毛色型水貂T138A位点多态性并进行分析，结果表明该位点在5种毛色品种水貂中存在T和A这2个等位基因，可形成3种基因型：TT、TA和AA。其中吉林白水貂T138A位点AA基因型频率最高，而在具有黑色被毛金州黑水貂群体中未检测到该SNP位点。综上，TYR基因的138TGT→TGA、c.78A＞T、T138A和外显子4序列缺失这些变异可作为水貂白色表型育种的遗传标记。

美洲水貂TYRP1基因由7个外显子组成，全长编码序列为1.6 kb，编码537个氨基酸，形成不稳定的亲水蛋白质[21]，该蛋白通过调节酪氨酸酶的活性，影响黑色素小体结构和黑色素细胞的增殖与凋亡以及黑色素的合成[22]。Berryere等[23]研究发现褐色表型是由TYRP1基因的突变产生的。Kenny等[24]研究发现TYRP1基因的少量突变可导致人类眼皮肤白化病3型。Cirera等[25]发现TYRP1基因内含子2中1个长插入片段与美洲水貂帕洛米诺毛色表型存在关联。综上，一般认为TYRP1基因是影响水貂毛色变淡的主效基因，下一步应加大水貂群体数量，进行该基因与水貂毛色相关变异位点的筛查工作，检测到的变异位点可作为水貂毛色选育的遗传标记位点，从而加速新毛色和新品种水貂的培育。

Agouti是真黑色素与褐黑色素合成的开关[26]。Agouti基因位点首次被发现是由于其对哺乳动物被毛色素类型和时间沉积的影响[27]，现在已经在小鼠的Agouti基因位点发现了许多突变，其中一些影响皮毛颜色。宋兴超等[28]发现Agouti基因内含子2上的SNPs（g.1189CT）的CT基因型与吉林白水貂被毛表型显著相关；在内含子3中的1个SNPs（g.252CT）位点CT基因型与珍珠水貂的毛色具有相关性，同时发现5个SNPs和2个缺失突变位点在不同毛色水貂群体中分别处于紧密连锁状态且可能与水貂浅色被毛表型相关。因此，水貂Agouti基因g.1189CT和g.252CT这两个变异位点可能是影响美洲水貂被毛颜色的分子遗传标记位点，这为研究美洲水貂毛色的选育奠定了理论依据。

最新研究针对两种群美国水貂进行了全基因组测序，发现MLPH基因和MITF基因与银蓝水貂和黑眼白水貂毛色表型相关[29]。MLPH编码黑素亲和素参与黑素体运输的Rab蛋白并且能使黑素体结合的RAB27A基因和运动蛋白MYO5A相互作用，MLPH包含N-末端rab27结合域（RBD）、内侧肌O5A结合域（MBD）和C-末端肌动蛋白结合域（ABD），增强了MLPH与MYO5A12的相互作用且C端域能与微管相关蛋白EB1[29,30]相互作用。成熟黑素小体在细胞内运行是以RAB27A-MLPH-MYO5A三重复合体的形式[29]。研究发现，银蓝色水貂MLPH基因的外显子7缺失，导致发生移码突变和308位氨基酸变为终止密码子[29]，该突变使蛋白缺失C端肌动蛋白结合域和外显子F结合域（EFBD），且两者都是MYO5A结合域的组成部分。之前的研究表明，MBD的EFBD区域对于RAB27A-MLPH-MYO5A三重复合体的形成是必需的，而MYO5A-MLPH的结合需要ABD区域[29]，因此MYO5A的功能缺失干扰了成熟黑素体向富含肌动蛋白的黑素细胞树突尖端的运输，导致毛色变浅。大量研究表明MLPH基因与银蓝色貂毛色具有相关性[29，30]，采用全基因组测序方法在MLPH基因剪接供体位点发现了一个可能导致功能丧失的单核苷酸变异GL896909.1:662639 G/A（MLPHC.901+1G＞a），该突变位点与银蓝水貂表型有关[29]。另外的研究也证实相同的结论，Cirera等[31]研究发现银蓝水貂MLPH蛋白的基因组序列中缺少内含子7和部分内含子8，在cDNA水平上缺少完整的外显子8，导致其结合域非常短，造成MYO5A Va结合域的功能丧失。这一突变使黑素体在黑素细胞中分布减少，并最终导致淡银蓝色的被毛。此外，研究证实了之前关于水貂遗传的信息，表明控制银蓝色的基因座存在不止一个等位基因[32]。进一步采用单链构象多态性（single-strand conformation polymorphism,SSCP）技术对我国辽西地区标准色与深咖啡色水貂的MLPH基因外显子进行遗传多态性分析，但未检测到变异位点，分析认为该基因在这两种色型水貂个体间相对保守，也可能由于PCR-SSCP在方法上的局限，对于那些不影响单链构象的SNPs，试验过程中也可能被漏掉[33]。综上，可以针对MLPH基因进行限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism,RFLP）、微卫星、PCR-SSCP和单核苷酸多态位点（SNPs）等多种分子标记研究，从而找到影响水貂毛色的关键性突变，为培育出彩色水貂提供重要依据。

MITF基因的黑素细胞-特异功能异构体MITF-M能影响神经嵴源性黑素细胞的发育，使毛皮颜色发生白化，研究发现MITF的基因座与黑眼白水貂的表型具有相关性[32]。早期的研究并没有在黑眼白水貂的MITF基因中筛查到变异位点，但最新研究发现MITF基因GL896899.1:18635719G/A位点的变异与黑眼白水貂被毛表型相关[29]。

2 分子育种技术在水貂针绒毛性状相关基因中的应用

毛绒品质是毛的颜色和纯度、毛的结构和长度以及毛的密度等的综合性状，水貂的毛绒品质由被毛密度、针毛和绒毛长度、绒毛细度及针绒毛长度比等因素决定。被毛密度是影响毛皮品质的重要因素，被毛稀疏会让毛皮看起来杂乱、无光泽[34]。为了得到较好针绒毛长度的水貂后代，我们应选育绒毛丰厚、长度较长的水貂亲代，在冬毛期注重水貂的饲料营养配比[35]。针绒毛长度比应适当才可以保证毛皮的外观和质量。Cadieu等[36]研究发现，影响水貂毛长度、粗度和卷曲毛发变异的主效基因非常少。Thirstrup等[37]研究发现，在9个常染色体上发现QTL对水貂毛长度和毛密度均有影响。已有研究表明，犬的短毛比长毛占优势，而长毛性状是由FGF5（fibroblast growth factor 5）基因突变引起的[38]。研究FGF5基因的BAC文库发现1个微卫星标记（RAN110），其与被毛长度性状无显著相关性。在水貂的11号染色体上，在RAN110标记附近发现了1个与被毛长度性状相关的QTL[39]。

成纤维细胞生长因子5（FGF5）是纤维母细胞生长因子家族的一员，目前的研究认为FGF5主要通过影响周期性活动，控制毛囊从兴盛期向休眠期转换，最后影响了被毛的长度[40]。Jin等[41]使用RNA-seq测序技术发现通过促进FGF5基因的表达来调控绒山羊毛发的生长发育。梁东[42]针对FGF5基因在不同品种水貂体组织中的表达量进行差异分析，发现FGF5基因mRNA在美国短毛黑色水貂中表达量要高于金州黑色标准水貂，并且金州黑色标准水貂较美国短毛黑水貂针毛长差异极显著（P＜0.01）。笔者得出FGF5基因的表达量与水貂针毛长相关。研究发现在犬的第13号染色体上有1个RSPO2（R-spondin2）基因，该基因可影响毛的细度，RSPO2基因位于水貂4号染色体上并检测到一个可能影响水貂毛细度的数量性状基因座[39]。下一步研究应运用PCR-RFLP分子育种技术筛查水貂FGF5基因和RSPO2基因与毛长、毛细度性状相关的突变位点，上述突变位点可作为水貂毛长性状选育的分子遗传标记，进一步加速水貂的育种工作。

3 小结与展望

毛绒品质是毛皮动物的重要生产性状和主要育种目标，也是一种可利用的遗传标记，在确定杂交组合、品种纯度和亲缘关系等方面均有一定的用途。另外，水貂皮的绚丽多彩和经济价值也存在直接的关系，可以根据人们的需要及毛皮市场行情，利用分子标记辅助选择技术加快彩貂新品种的培育，毛皮动物养殖的经济价值也必将得到进一步提高。

分子标记辅助育种是筛选与育种目标性状紧密连锁的分子标记，是目前应用最广泛的分子育种方法。传统育种是在表型上进行选择而不关注基因型的改变，而分子标记辅助选择育种则注重基因型的改变。传统选育过程中由于表型较好，但基因型不稳定的现象出现，导致后代发生性状分离，难以培育优良的品系。然而分子辅助选择育种能够突破这一限制，可快速稳定地获得优良品系[43]。分子标记虽然为水貂育种开辟了一扇大门，但能否在育种实践中发挥应有的作用，还需要注意以下4个方面：是否能找到与目的基因性状紧密连锁的分子标记；是否能绘制遗传标记多态性丰富的遗传图谱；能否实现自动化分析分子标记，简化试验，大大降低成本；是否能改进预测育种值的方法。当前，分子育种技术在水貂育种中取得了一定的成果，已经筛查到大量的变异位点与水貂经济性状相关，这些位点可作为分子标记；利用微卫星标记、RAMP、PFLP和MAS技术进行水貂遗传多样性的研究，为绘制遗传标记多态性丰富的遗传图谱提供理论数据；成功通过BLUP数字模型方法进行水貂育种值预测，为下一步育种奠定理论基础。随着生物技术的飞速发展，分子标记将在水貂育种中占有重要地位。