鸡新城疫抗体水平测定技能竞赛中的注意事项

李秀富，朱锋钊

(铜仁职业技术学院，贵州 铜仁 554300)

高职院校农林牧渔类“鸡新城疫抗体水平测定”技能竞赛是由教育部发起，农业农村部主办，学校、行业、企业共设的赛项。赛项测定方法按照中华人民共和国《新城疫诊断技术》(GB/T 16550—2008)国家标准，操作方法简单，结果判定方便，但竞赛时间较长，往往因器材准备不合理或选手操作不规范而影响试验结果。笔者作为我校近几年该技能竞赛国赛和省赛的指导教师，现就技能竞赛中影响试验结果的因素进行归纳总结，以供参考。

1 试验器材正确规范使用

在竞赛第1环节中，除了物品标识，重点是考察托盘天平和离心机的规范使用，竞赛物品准备的均为500 g载荷托盘天平。在试验使用前，应将两侧托盘架下方的保护套取下，将平衡螺母调至最里侧，砝码归零，观察天平敏感性。然后选择质量相近的2个小烧杯置于托盘中央调平，将离心管规范装入对角取出的离心机套管并放入托盘天平烧杯内进行生理盐水配平。在离心管装入离心机套管配平时一定要精准，否则将影响离心机正常使用并使离心机产生较大杂音，严重影响离心机转数和血细胞压积，对清洗红细胞和最终吸取红细胞压积都会产生不良影响，最终可能会导致1%红细胞悬液配置不精准。

2 反应温度与时间

鸡新城疫抗体水平测定试验属于血清学实验中的血凝与血凝抑制试验，温度对试验结果影响较大。温度过高(大于37 ℃)不仅会造成水分蒸发和反应物解离，甚至还会造成红细胞自溶，作用时间变短；温度低于20 ℃则会使反应速度变缓；温度过低(小于4 ℃)不仅红细胞会发生自凝，还会影响试验结果的判定时间或与标准结果相差1～2个滴度[1]。为了保证试验结果的准确性和竞赛公平公正，在竞赛前和整个竞赛过程中应将场地内每个工位室温尽可能控制在20～25 ℃。

3 规范精准移液

在技能竞赛中造成移液不精准的因素很多，概括起来主要包括：吸头与移液器型号是否完全匹配，装配移液器吸头是否规范，吸头有无润洗，移液前是否校准移液器，移液是否做到“慢吸，快打”，倍比稀释混匀是否产生气泡，移液是否有液体溅出等。操作的每一个细小失误或动作标准不一致都会造成结果误差，甚至没有结果。所谓“差之毫厘，谬以千里”，所以在竞赛操作中要求每位选手必须谨小慎微、规范操作。

4 准确适量配置1%红细胞悬液

技能竞赛要求准备非免疫公鸡1只，要求竞赛准备方认真检测鸡是否有禽流感、新城疫等相关抗体。在采血时采血器要先抽取抗凝剂再采血，若加入抗凝剂的时间、方法不当产生了血凝块，对红细胞悬液配置会有很大影响[2]。采血过程中2人要默契配合，抓鸡做到轻、稳、准、巧，让鸡安静舒适地躺卧在鸡笼上保定，消毒采血部位后，采血操作者要稳、准、快地采足所需翅静脉血液量，采血完毕一手用干棉球按压止血，另一手盖上采血器针帽，适度轻晃采血器以防凝血[3]。拧掉采血器上的针头，将抗凝血沿离心管壁轻缓注入离心管中，再缓慢加入3～4倍生理盐水混匀洗涤、配平，2 000 r/min离心5～8 min，洗涤4次，吸干净血小板和白细胞，按照竞赛用量配置适量红细胞悬液，且所使用的生理盐水使用前要灭菌并标定pH值至7.2。若配置的1%红细胞悬液浓度过高，如有润洗吸头，则会出现沉降血点变大；反之，则会出现沉降血点变小，血沉速度减慢，血凝滴度升高，血凝抑制滴度下降，影响结果判定甚至误判。

5 正确选择96孔V型血凝反应板

96孔反应板选择是否正确对试验结果会产生较大影响。在学生练习中，我们选择有机玻璃板、亚克力细胞培养板、一次性96孔反应板(底部分U型和V型，孔底有110度和90度)，对比试验结果差距甚大，板孔倾斜的角度会影响红细胞的沉降速度，细胞培养板严重影响血凝试验判定结果，效果最好的是一次性96孔V型90度血凝反应板。此外要保证板面水平、孔底洁净，避免使用陈旧反应板和有污物或弯曲倾斜等不合格的反应板，否则会因非特异性凝集出现结果不正确或跳孔现象[4]。

6 抗原对试验结果的影响

抗原是影响新城疫检测结果的主要因素之一，同一抗原最好2瓶以上混匀配置分装使用。若抗原变质、陈旧或反复冻融等都会影响红细胞的凝集力，造成解凝现象，严重影响试验结果，所以抗原必须新鲜。4HAU的配置是根据血凝试验结果进行的，在判读血凝试验结果时一定要严格按照《鸡新城疫诊断技术》(GB/T 16550—2008)标准准确判读，然后精确计算出生理盐水和抗原的量，选择适量的移液器先于小烧杯内准确加入生理盐水，再加入抗原吹洗混匀。若混匀不均，浓度高的血凝抑制价会降低，浓度低的血凝抑制价会升高。竞赛中因4HAU病毒抗原浓度对试验结果会造成不可逆转的影响，所以在时间允许的情况下，最好做1次回归验证，以校正4HAU病毒的配置浓度。

7 判定结果时间及判定标准

根据《鸡新城疫诊断技术》(GB/T 16550—2008)标准，在结果判定上不管是血凝试验还是血凝抑制试验均要铭记“明显”和“完全”2字。“明显”是2个试验均以生理盐水对照孔红细胞呈“明显”钮扣状沉淀到孔底为判定标准；2个“完全”区别在于：血凝试验时，正面倾斜反应板后红细胞“完全”不流动，即以完全凝集病毒的最大稀释度确定为该抗原的血凝滴度；血凝抑制试验时，反面倾斜反应板，以红细胞呈泪珠状“完全”流下判读为血凝抑制的滴度。总之，正确判定结果的时间是以阳性、阴性和生理盐水对照成立前后5 min内判定记录结果最好[2]。

8 小结

上述影响“鸡新城疫抗体水平测定”结果的因素仅是笔者近几年指导学生技能竞赛的一些体会，在实际生产和工作中，影响抗体水平测定结果的因素还很多，每一环节都应做到认真细致，严格按照规程进行重复规范操作训练和提炼总结，发现问题及时纠正，才能保证试验结果的准确无误，才能让参赛选手在竞赛中拿到好成绩，更好地指导生产实践。