牙周细胞膜色谱联用高效液相筛选三七有效成分的研究

刘 丽，张 新，李 成，代 雯，李佳琦，尹 东

慢性牙周炎是常见的口腔疾病，在我国患病率高达96.80%[1]。目前慢性牙周炎的治疗方法仍然是基础治疗、手术治疗及药物治疗。临床上常用的药物多为全身口服、含漱剂等抗生素类，虽能快速改善症状，但药效维持时间短[2]；中药亦能有效改善症状，且毒副作用小。中药有效部位的提取方法很多，其中超声萃取是一种非常有效的方法[3]。高效液相色谱法(HPLC)测中药有效成分及浓度，具有高效、高灵敏度、分析速度快以及载液流速快等特点[4]。细胞膜色谱法(CMC)能够在特定的活性细胞膜筛选模型上直接确定与膜受体发生结合的中药某种活性部位和活性成分，进一步进行分离和鉴定，从而达到快速、高效和准确筛选的目的[5]。牙周膜细胞的分离培养是体外研究牙周组织的良好实验模型[6]。辛伐他汀(SIM)对牙周组织的抗炎和再生有直接或间接作用[7]，适宜浓度SIM能促进人牙周膜细胞(hPDLC)增殖、ALP活性以及细胞成骨转化，且可能与ERK、Wnt、BMP信号通路有关[8]。本研究通过HPLC联合CMC法对牙周膜细胞膜与中药三七的有效成分进行筛选，以期能对牙周炎防治的新药开发做初步的筛药实验。

1 资料与方法

1.1 一般资料：Hair生物安全柜(青岛海尔特种电器有限公司)，CO2培养箱(BB16)(德国 Heraeus)，倒置相差显微镜(日本 Nikon)；细胞膜色谱柱芯组件(10 mm柱长，2 mm 内径，0.22 μm 筛板孔径)(深圳逗点生物技术有限公司)；RPL-ZD10型装柱机(大连日普利科技仪器有限公司)；VICI AG 10G-0911V10通切换阀(美国 Valco仪器公司)；Concentrator真空旋转蒸发仪(德国eppendorf公司)；Shim-pack VP-ODS液相色谱柱预柱(10 mm柱长，1 mm 内径，5 μm 粒径，C18键合硅胶固定相)(日本Shimzdzu公司)；LC-MS-2010EV 高效液相色谱-质谱联用仪系统(包括2部 LC-20 液相色谱泵，Shim-pack VP-ODS 高效液相色谱柱，SPD-20A UV 检测器，SPD-M20A DAD 检测器)。

1.2 试药：三七购自于国大药房(经鉴定为三七)，试药辛伐他汀(SIM)对照品(中国北京药品生物制品检验所，纯度≥98%)；阳性药物对照品人参皂苷Rb1编号：R-012，人参皂苷Rg1编号：R-010(上海远慕生物科技有限公司，纯度≥98%)；胎牛血清、培养基DMEM、胰蛋白酶(GIBCO，美国)；乙腈，甲醇为色谱纯(Fisher，美国)；ZEX-Ⅱ大孔硅胶(青岛美高贸易有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 药物制备：三七粉末10 g，用40 mL的甲醇-水(70∶30，v/v)溶液超声提取30 min×3次，取上清液真空干燥，色谱甲醇复溶得到三七的甲醇总提取物，2 mL去离子水使其完全溶解，再依次加入极性不同的有机溶剂(石油醚、乙醚、氯仿、乙酸乙酯)各10 mL，超声提取30 min×3次，分别收集6种部位的提取液，干燥后甲醇复溶、过滤。

1.3.2 hPDLC/CMC色谱柱制备：将4～8代hPDLC用10 mL Tris-HCl低渗液制备成细胞膜悬液5 mL动态加入装有活化硅胶载体的支口试管，次日将混合液洗涤收集沉淀加入10 mL去离子水，涡旋震荡混匀，即得hPDLC/CMC 固定相悬液湿法装入细胞膜色谱柱芯柱套中即得hPDLC/CMC 色谱柱，连接至色谱系统中使用。阳性药物SIM对hPDLC/CMC进行测试分析并考察其适用性，为了验证hPDLC/CMC 对其膜表面受体特异性结合的药物具有分离保留活性，将0.2 mg/mL SIM溶液5 μL注入色谱系统，比较在相同长度的纯硅胶色谱柱和hPDLSC/CMC色谱柱上的保留特性及活性持续时间，并记录CMC色谱图。将一根hPDLC/CMC色谱柱充分平衡后，连续进样 5 μL 0.2 mg/mL 的 SIM 3次，以保留时间为指标来考察色谱柱的内差异性，此外按照相同方法制备 3根hPDLC/CMC 色谱柱，同时将 3根色谱柱置于液相色谱内，在相同条件下分别进样 5 μL 0.2 mg/mL SIM，以每根色谱柱上的保留时间峰面积为指标，考察柱间差异性。利用3次富集组分的峰面积得出富集后的平均峰面积来计算相对标准偏差(RSD值)，要求符合定性实验RSD<5%。

1.3.3 供试品测定：将hPDLC/CMC色谱柱连接入液相色谱系统中，根据2010《药典》及文献研究[9]选定的色谱条件：流动相(去离子水、5 mmol/L磷酸盐缓冲液)；柱温：37.5 ℃；流速：0.2 mL/min。辛伐他汀定容至0.2 mg/mL，检测波长：238 nm；三七各提取物定容至1 mg/mL，人参皂苷Rb1、Rg1阳性对照品定容至0.2 mg/mL，检测波长：203 nm。用流动相平衡2～3 h 待基线平稳后，吸取供试品溶液5 μL注入色谱系统进行分析测定，并采用UV检测器记录CMC色谱图。三七提取物中活性成分的筛选与分析：吸取三七各部位的提取液注入色谱系统进行分析测定，将能够在hPDLC/CMC上产生良好保留峰形的三七提取物称为其活性部位。再吸取三七的主要成分人参皂苷Rb1、Rg1[10]阳性对照品进样检测与保留峰形进行比较，对保留的活性成分进行初步鉴定。

1.3.4 数据图形分析：本研究实验数据的RSD值 =标准差(SD)/计算结果的算术平均值(X)×100%，它是一种量度数据分布的分散程度标准，用以衡量数据值偏离算术平均值的程度。标准偏差越小，这些值偏离平均值就越少，反之亦然。制图采用Graphad Prism 5.0 和Origin 2019b等制图软件进行。

2 结果

2.1 辛伐他汀色谱图：辛伐他汀系统在hPDLC/CMC色谱柱具有很好的分离及保留活性，可见hPDLC/CMC 色谱柱在10 min 左右有明显的保留色谱峰出现，而在纯硅胶色谱柱上并无任何保留，说明SIM在hPDLC/CMC 有保留是因为硅胶表面包覆的hPDLC 膜受体和SIM之间的特异性结合作用导致，而纯硅胶柱上则没有这种特异性结合。色谱柱由于其受体活性存在而对药物具有一定的分离活性。色谱柱内及柱间RSD值均<5%，见表1。

2.2 三七色谱图：辛伐他汀色谱图作为阳性对照(图1，目录后)。三七的主要成分人参皂苷Rb1、Rg1阳性对照品进样检测均产生良好保留峰形(图2-图3,目录后)。三七6个提取部位均能够在hPDLC/CMC上产生良好保留峰形。

3 讨论

中药在口腔疾病的研究与治疗相对较少，其在调节免疫力，增强牙周组织的防御修复和再生能力有良好的效果[11]。而牙周炎是多发且难以治愈的口腔慢性感染性疾病，治疗牙周炎可以汲取中医药的精髓，发挥其优势，从而对牙周炎产生较好的防治效果。三七具有止血、散疲、消肿止痛、保护心肌细胞、降血脂、抗血栓、增强免疫力、抗炎、抗纤维化、消除氧自由基等作用[12]。三七总皂昔对多种实验性模型有良好的抗炎作用[13]：它能对抗组胺，5-羟色胺等致毛细血管通性增加及炎症组织前列环素的释放，抑制巨噬细胞受到炎症刺激和白介素的释放[14]。而三七在口腔疾病的研究与治疗较少，本研究通过牙周细胞膜色谱联用高效液相分析色谱峰，用新的实验方法与理念发现三七各部位提取物均能与人牙周细胞膜亲和富集，说明hPDLC/CMC色谱柱对三七的各个提取成分具有很好的分离及保留活性，三七药物内的某活性成分能够与人牙周膜细胞膜有亲和靶点，并能够在局部作用一定的时间，从而发挥它的药理作用，这为研发三七新药物能够发挥在牙周局部吸收药物效能提供了理论支持。但是具体的亲和靶点并不确切，依据文献得知三七的主要活性成分为人参皂苷Rb1、Rg1等[10]，通过前面的实验结果假设三七的主要活性成分Rb1、Rg1能够与牙周细胞膜有靶点，通过检测结果证实假设成立，并明确了利用固定相包覆的牙周细胞膜表面特定活性膜受体与Rb1、Rg1配体之间有“受体-配体”亲和作用的靶点，这种特异性结合的实验结果为课题组研究三七活性成分Rb1、Rg1 对人牙周膜细胞的作用奠定了基石。但是活性部位在具体哪个膜受体且如何作用的机理尚不明确，需要深入的研究。药物筛选是发现有效治疗人类疾病药物的基础，药物靶标的发现和验证是新药研发的第一步，也是药物筛选及药物定向合成成败的关键因素之一[15]。本研究为三七的活性部位治疗牙周炎疾病提供了新的理论知识，为治疗口腔疾病新的中药研发提供依据。

由于中药成分复杂，目前尚无完整系统的研究明确具体是中药复杂体系中的哪个部位或者成分针对不同的细胞或者疾病发挥药理作用。本研究结果说明hPDLC/CMC分析方法作为一种体外二维生物亲和色谱方法，能够快速高效地筛选、分离并鉴定出中药复杂成分中与牙周细胞膜表面有特异性结合的活性化合物，从而为特异性筛选用于治疗疾病的中药活性化合物提供新的思路和方法。