去唾液酸糖蛋白受体在肝脏疾病诊治中的应用及研究进展

胡虎兰，姚金金

(1.杭州市第九人民医院 消化内科，浙江 杭州 311225；2.杭州师范大学附属医院 药剂科，浙江 杭州 310015)

中国是肝病大国，现有的肝病种类包括病毒性肝炎、自身免疫性肝病、酒精性肝病、非酒精性脂肪肝、肝纤维化、肝硬化、肝癌等[1]。随着疾病进展，任何种类的肝病均可出现进一步恶化，肝脏疾病的有效诊治显得尤为重要。去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor，ASGPR)是肝细胞膜表面的一种异源低聚物内吞受体，又称为半乳糖/N-乙酰基葡糖胺受体、Ashwell-Morell受体、肝凝集素。ASGPR特定于肝细胞膜表面，特异性识别、结合并转载糖蛋白[2]。本文综述目前ASGPR在各类肝脏疾病诊治中的应用。

1 肝脏疾病流行病学现状

据WHO报道，每年有一定数量的肝病患者死亡，2015年约有134万人死于病毒性肝炎。病毒性肝炎按病原学可分为甲型、乙型、丙型、丁型和戊型。全球每年约140万人感染甲型肝炎病毒(hepatitis A virus，HAV)，HAV主要通过粪—口传播，因此其发病率随经济水平及卫生状况波动。尽管甲型病毒性肝炎属于自限性疾病，但易引起大规模暴发和流行，且当前甲肝疫苗及治疗药物尚不成熟[3]，严重者仍可引起死亡。2015年，全球约有1.1万人死于HAV感染。全球乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染者高达2.57亿，我国高达7千万。近年来，乙肝疫苗及抗HBV药物应运而生，HBV感染控制成效显著，然而HBV仍无法达到完全根治的目的，全球每年约有88.7万人死于HBV感染[1]。全球约有7 100万人感染丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)，每年约有39.9万人死于HCV感染并发症，现有的抗病毒药物存在治疗适应证局限及不良反应[4]。全球每年约有2 000万人感染戊型肝炎病毒(hepatitis E virus，HEV)。戊型病毒性肝炎属于食源性人畜共患疾病，大部分HEV感染者存在临床表达沉默和自我限制的特点，但仍有引起慢加急或急性肝衰竭的风险，急性暴发流行多见于卫生条件落后的国家，每年约有5.6万人死于HEV[5]。

自身免疫性肝病(autoimmune liver disease, AILD)受遗传和环境等因素影响，发病机制复杂，治疗方法不一，易合并出现肝硬化。禁锢于现有的诊断手段，自身免疫性肝病的发病率统计并不完全[6]。随着生活水平的提高，酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)及非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)发病率逐步提升，全球每年有330万人死于过量饮酒[7]，NAFLD患病率为6.3%～45.0%，其中中东和南美洲患病率最高，亚洲最低[8]。

肝纤维化是肝硬化的早期阶段，肝硬化、肝癌是肝病的终末环节且不可逆转。据统计，肝癌是全球第五大常见肿瘤，在肿瘤致死率中排名第2[9]。

2 ASGPR概述

2.1 ASGPR结构 ASGPR由46 kD主要亚基ASGPR(H1)和50 kD次要亚基ASGPR2(H2)组成，含量比为3：1，均为Ⅱ型单次跨膜糖蛋白。ASGPR主要分布于肝小叶的门静脉周围，每个肝细胞约有1×105～5×105个结合位点，富集于网格蛋白聚集处。ASGPR根据功能区划分为胞质区、跨膜区、蒂区和糖识别域，其中因糖识别域识别并结合配体的机制为钙离子依赖，故属C型凝集素。配体被H1亚基有效识别结合后，通过H1、H2亚基共同完成内吞作用。ASGPR亦分布于细胞内囊泡组织、内质网和高尔基体中，参与一系列的运输过程，配体最终在溶酶体中被降解[10]。

2.2 ASGPR检测方法 目前，ASGPR有多种检测方法，基础步骤为以pET3-CRDH1为模板设计引物，PCR扩增CRDH1基因，定向克隆至原核表达载体pET-32c中。含有CRDH1/pET-32c的BL21单菌落通过TPTG诱导表达，Ni2+螯合柱亲和纯化其表达产物。H1/H1b最终检测方法可采用：(1)免疫印迹技术分析其免疫反应性，该方法对H1b亚基特异性识别，尤其是天然构象的内源性H1b亚基，但不识别H1a亚基，且该检测方法要求采用肝脏组织标本[11]。(2)间接法rH1-IgG-ELISA，该方法具有较好的敏感性及特异性，对检测标本的纯度要求不高，但操作过程复杂，成本高[12]。(3)捕获噬菌体酶免疫吸附试验法，该检测方法假阳性率低，具有高效率的筛选能力，但对标本纯度要求苛刻[13]。(4)流式细胞术和免疫组织化学法，该检测方法特异性良好，可用于鉴别原发性肝癌及转移性肝癌，但对肝组织细胞完整性要求高[14]。H2检测方法可采用半定量逆转录聚合酶链式反应技术(RT-PCR)，该方法基于mRNA水平检测，特异性高，仅需血清标本即可完成，操作简便[15]。H2a检测方法可采用双抗体夹心酶联免疫吸附法，该方法操作简单且已制备成试剂盒，具有稳定性好、特异性强、灵敏度高、准确度高等特点，对标本要求不高，但仍需大样本检测优化方法[16]。

3 ASGPR在肝脏疾病诊治中的应用

3.1 病毒性肝炎

3.1.1 甲型病毒性肝炎 HAV与ASGPR相关性的研究较少。Dotzauer 等[17]采用定量检测HAV负链RNA，表明HAV通过形成HAV-抗HAV IgA复合物经ASGPR介导进入肝细胞内。进入细胞内后，HAV逃逸，基因组RNA释放，病毒大量复制，导致肝脏疾病恶化。

3.1.2 乙型病毒性肝炎 Sewing等[18]利用HBV通过ASGPR介导完成肝细胞感染机制制备的抗病毒药物具有靶向性强和肾脏毒副作用小等优点。HBV附着于PreS1区的21～47氨基酸位点，一种50 kD的糖蛋白(含有N-乙酰半乳糖胺和N-乙酰氨基葡萄糖残基)通过特异性结构域结合PreS1区，使HBV能被ASGPR识别并介导进入肝细胞内，HBV入胞后开始复制工作[19]。Vyas等[20]在研究胎盘滋养细胞时发现，母体HBV感染者ASGPR表达增加；通过免疫荧光检测到在滋养层和胎盘树突状细胞中存在ASGPR和HBV共同位点，认为树突状细胞是HBV载体，能被ASGPR识别，通过ASGPR通道完成HBV的内吞、结合和摄取过程。但ASGPR在垂直传播中的作用并未被证实。Javanbakht等[21]将用于抗病毒治疗的单链寡核苷酸(single-stranded oligonucleotide，SSO)置于锁核酸(locked nucleic acid，LNA)平台，形成LNA-SSO复合物。该LNA-SSO复合物与3个N-乙酰半乳糖结合，可特异性识别肝细胞表面的ASGPR，经该受体介导进入肝细胞内，达到高效的抗病毒作用。Latavia等[22]采用ASGPR特异性配体(包括半乳糖、乙酰半乳糖胺、亚细胞苷)尝试标记载体，与药物结合运送至肝细胞内，提高药物摄取率。随着研究进展，新的ASGPR特异性配体层出不穷，包括纳米粒子(无机纳米粒子、高分子纳米粒子)、脂类(可电离脂质纳米粒子、阳离子脂质、脂质体、高密度脂蛋白、固体脂质纳米粒子)、细胞穿膜肽、HBV附着物抑制剂。

3.1.3 丙型病毒性肝炎 研究[23]表明，HCV p7可上调ASGPR1基因表达，ASGPR1启动子顺式激活下游基因，促进HCV与肝细胞结合。利用siRNA制成的靶向制剂可显著增加HCV清除率。Lakshminarayanan等[24]采用聚丙烯醚亚胺树突状大分子，与siRNA相互作用结合，靶向传递siRNA至肝细胞内HCV核周区域，可有效抑制HCV复制。Willoughby等[25]研究表明，GalNAc-siRNA技术可应用于肝靶向，且可降低ASGPR表达的疾病状态。

3.1.4 戊型病毒性肝炎 目前，HEV与ASGPR相关性研究较少。Zhang等[26]通过免疫沉淀、下拉和酶联免疫吸附试验，发现HEV ORF2蛋白直接与ASGPR1和ASGPR2的外区相互作用，促使HEV与肝细胞结合并进入肝细胞内，导致HEV感染的发生。

3.2 自身免疫性肝病 ASGPR抗体对AILD的诊断特异性高，免疫系统中的部分免疫球蛋白经ASGPR介导进入细胞内；AILD患者血清中ASGPR抗体含量高，可作为检测、评估病情轻重及预后情况的重要标志[27]。

3.3 酒精性肝病 乙醇可引起肝细胞ASGPR表达下降，损害ASGPR功能，ALD的损伤程度与ASGPR存在相关性。ASGPR可识别末端含有半乳糖或N-乙酰半乳糖残基的糖蛋白，可去除潜在有害的去解离糖蛋白，同时参与凋亡细胞的摄取[28]。ALD患者中的ASGPR表达下降，但仍保存部分ASGPR通道的完整性。Wang等[29]将当归多糖(angelica sinensis polysaccharide，ASP)通过酯化反应合成双性胆固醇半琥珀酸-ASP(ASP-CHEMS)，再装配成ASP-CHEMS纳米粒子，合成ACNPs。ACNPs可有效结合ASGPR，并利用ASGPR通道进入肝细胞。相较于ASP通过非ASGPR通道进入肝细胞，前者使ASP具有更高的溶解性、光稳定性及肝脏靶向性，达到更好的治疗效果。基于ACNPs可利用ALD患者仅存的ASGPR通道达到更好的治疗效果。

3.4 非酒精性脂肪肝 ASGPR1属于肝细胞源性循环细胞外囊泡(circulating extracellular vesicles，EVs)，而EVs是非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)的新兴生物标志物，Li等[30]发现在NASH小鼠中，ASGPR1随着饲养周期延长而逐步升高，ASGPR1可作为NASH诊断和随访的新生标志物。

3.5 肝纤维化 在肝纤维化患者中，ASGPR水平降低。Wang等[31]采用ASGPR染色法在小鼠中得到了证实。

3.6 肝硬化 景博琼等[32]通过研究发现，肝硬化患者的抗ASGPR水平明显高于健康者及慢性肝炎患者，认为抗ASGPR有助于临床诊治的鉴别诊断，有帮助治疗和评估预后的价值。

3.7 肝癌 Ding等[33]研究发现，肝癌中ASGPR1基因表达下调，认为ASGPR1水平与肝癌晚期淋巴转移TNM分期有关，推测ASGPR1可抑制肝癌的发生发展，并抑制肝癌转移和侵袭。肝癌靶向治疗药物与乳糖化衍生物结合，通过ASGPR介导进入肝细胞内，既增强抗肿瘤药物的疗效又减少对其他组织的毒副反应。研究[34-37]发现，可用于结合ASGPR的载体包括糖基化前药、糖基化小分子纳米药物载体、糖基化基因复合物，其中糖基化小分子纳米药物载体包括聚合物胶束、脂质体、糖基化壳聚糖载体、树枝状聚合体、金纳米粒子、果胶等。

4 总结和展望

综上所述，ASGPR肝脏特异性强，参与肝脏疾病的发生发展。目前基于ASGPR制备了部分新型制剂，当前制剂仍以动物实验应用为主，还未真正应用于临床医疗，亟待进一步深入研究，以发挥其更大的临床价值。