RP-HPLC-UV 法测定经典名方金水六君煎中橙皮苷的含量*

宋小雪，陈忠新，闫丽莉，张文娓，田 明

（黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨150040）

中华传统的中医药文化是中华民族的瑰宝，国家食品药品监督管理局联合国家卫计委等部门出台了《中药经典名方复方制剂简化注册审批管理规定》[1]，筛选并公布了第一批经典名方目录，其中包含100 个古代经典方剂，收载于明代张景岳所著《景岳全书》中的金水六君煎也位列其中。该方中共有7味中药组成，现代临床上仍广为传用，有神效。调肺补肾，止咳化痰，降逆止呕为金水六君煎的主要作用，金水六君煎在临床上主要治疗慢性支气管炎、肺气肿、哮喘、肾虚咳嗽等呼吸系统方面疾病[2,3]。陈皮主要功效燥湿健脾，祛痰止咳[4]，为方中君药，本文采用RP-HPLC-UV 法对经典名方金水六君煎中陈皮的主要成分橙皮苷进行测定，对控制本方剂的安全性及有效性起到至关重要的作用，也为下一步制剂成型工艺及质量标准研究奠定基础[5]。

1 实验部分

1.1 仪器及试药

Thermo -Sciencetific Ultimate3000 高效液相色谱仪（配有四元泵、在线脱气装置、柱温箱、控温自动进样器和 UV 检测器，美国 Thermo 公司）[5]；BT125D电子分析天平（Sartorious）；HH-11-2 数显恒温水浴锅（上海助蓝科技有限公司）；KQ-500DB 数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

橙皮苷（批号：110721-201014，中国药品生物制品检定所）；正丁醇（AR 天津市鼎盛鑫化工有限公司）；HAc（AR 天津市富宇精细化工有限公司）；甲醇（色谱纯 DikmaPure）；水为纯化水，金水六君煎物质基准（自制）。

1.2 实验方法

1.2.1 对照品溶液的制备 取橙皮苷对照品5.0mg，精密称定，加少量甲醇溶解并定容至5mL 容量瓶中，得到浓度为1.0mg·mL-1的橙皮苷对照品溶液，利用0.45μm 微孔滤膜过滤，备用。

1.2.2 色谱条件 色谱柱选用十八烷基硅烷键合硅胶柱，以甲醇、HAc 和水为流动相，比例为 35∶4∶61；UV 检测波长为 283nm，流速设置为 1.0mL·min-1。进样量为10μL，柱温设置为30℃。

2 结果与讨论

2.1 供试品溶液的制备

2.1.1 萃取次数的考察与结果分析 精密称定金水六君煎物质基准1.5g，置锥形瓶中，加水20mL 使之溶解，移至分液漏斗中，加入提前配制好的水饱和正丁醇液萃取5 次，每次量取20mL，分别收集5 次萃取的正丁醇液，蒸干，用甲醇将残渣分别溶解，并定容至10mL 容量瓶中，即得。

表1 为供试品萃取次数结果。

表1 供试品萃取次数结果Tab.1 Result table of extraction number of samples

由表1 可知，5 次萃取所测得的含量加和为6.5343mg·g-1，前3 次萃取所测得含量加和占总量的97.82%，说明萃取3 次时橙皮苷含量可达97%以上，故将此供试品的萃取次数定为3 次。

2.1.2 供试品溶液制备方法的确定 根据上述试验结果，确定本品供试液制备方法如下：取金水六君煎物质基准1.5g，精密称定，置锥形瓶中，加水20mL使之溶解，移至分液漏斗中，加入提前配制好的水饱和正丁醇液萃取3 次，每次20mL，将3 次萃取所得上层正丁醇液合并，于水浴蒸干，所得残渣加少量甲醇溶解，并转移定容至10mL 容量瓶中，即得。

2.2 专属性试验（空白试验）

2.2.1 供试品溶液的制备 制备方法同“2.1.2”项下供试品制备方法。

2.2.2 对照品溶液的制备 同“1.2.1”项下对照品溶液。

2.2.3 阴性对照溶液制备 按照金水六君煎物质基准制备方法，制备出不含陈皮药材的供试品，照“2.1.2”项下供试品处理方法制备出陈皮阴性对照溶液。

2.2.4 试验方法与结果分析 照“1.2.2”项下色谱条件，将上述制备的供试品溶液、对照品溶液及阴性对照溶液于0.45μm 微孔滤膜过滤后装入液相进样小瓶中，放置于高效液相色谱仪中，设置程序自动进样各10μL，测定峰面积，记录色谱图。HPLC 色谱图见图1。

图1 色谱图Fig.1 Chromatograms of map

由图1 可知，橙皮苷出峰时间为8.86min 左右，且供试品峰分离度良好，在橙皮苷峰相近的保留时间内，阴性样品无色谱峰被检出，因此，可以说明阴性样品对橙皮苷的测定无影响，试验方法有效。

2.3 橙皮苷标准曲线的制备及线性范围

取1.2.1 项下对照品溶液，放置于高效液相色谱仪中，设置进样体积分别为 2、4、6、8、10、12、14μL，测定记录峰面积，即得。结果见表2。

表2 橙皮苷线性回归数据Tab.2 Hesperidin linear regression data

以橙皮苷对照品含量及其峰面积为横纵坐标，利用赛默飞高效液相色谱仪自动得到标准曲线，回归方程为∶Y=20.474X－0.6305，R2=0.9994，结果表明，橙皮苷在进样量为2~14μg 之间时线性关系良好，见图2。

图2 橙皮苷标准曲线Fig.2 Hesperidin standard curve

2.4 精密度试验与结果分析

取金水六君煎物质基准1.5g，精密称定，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，0.45μm 有机微孔滤膜过滤至液相小瓶中，每次进样10μL，连续进样6 针，计算橙皮苷含量与RSD 值。结果见表3，HPLC色谱图见图3。

表3 橙皮苷精密度试验结果Tab.3 Test results of hesperidin precision

图3 橙皮苷精密度考察色谱图Fig.3 Chromatographic chart of hesperidin precision investigation

由表3、图3 可知，在此色谱条件下，测定的橙皮苷峰分离度良好，且连续6 次进样的RSD 值小于3%，表明该高效液相色谱仪精密度良好。

2.5 重复性试验与结果分析

取金水六君煎物质基准1.5g，精密称定，共6份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，0.45μm 微孔滤膜过滤至液相小瓶中，设置进样体积为10μL，分别计算橙皮苷含量与RSD 值。结果见表4，HPLC色谱图见图4。

表4 橙皮苷重复性试验结果Tab.4 Repeatability test results of hesperidin

图4 橙皮苷重复性考察色谱图Fig.4 Chromatogram of hesperidin repeatability

由表4、图4 可知，在相同色谱条件下测定的6批供试品中橙皮苷峰分离度良好，且RSD 值小于3%，表明该方法有较好的重复性。

2.6 稳定性试验及结果分析

取金水六君煎物质基准1.5g，精密称定，按“2.3.2”项下确定的方法制备供试品溶液，0.45μm 微孔滤膜过滤至液相小瓶中，放置于高效液相色谱仪中，设置程序每隔1h 进样10μL，连续进样 12h，计算橙皮苷含量与RSD 值。结果见表5，HPLC 色谱图见图5。

图5 橙皮苷稳定性考察色谱图Fig.5 Chromatographic chart of hesperidin stability

表5 橙皮苷稳定性试验结果Tab.5 Test results of stability of hesperidin

由表5、图5 可知，测定的12h 内供试品中橙皮苷含量稳定，其RSD 值小于3%，说明该供试品处理方法所得溶液在12h 内测定橙皮苷含量均稳定。

2.7 加样回收试验与结果分析

取金水六君煎物质基准0.75g，精密称定，共6份，精密加入4.4mg·mL-1的橙皮苷对照品溶液1mL至每份样品中，按“2.3.2”项下确定的方法制备供试品溶液，0.45μm 微孔滤膜过滤至液相小瓶中，设置进样体积为10μL，计算回收率，结果见表6，HPLC色谱图见图6。

表6 橙皮苷加样回收试验结果Tab.6 Test results of hesperidin recovery by adding samples

图6 橙皮苷加样回收色谱图Fig.6 Chromatographic chart of hesperidin recovery by sampling

由表6、图6 可知，6 批供试品中的橙皮苷加样回收率在95%~105%之间，且RSD 值均小于3%，说明该处理方法测定橙皮苷含量准确。

2.8 含量测定

分别取不同批次金水六君煎物质基准1.5g，共15 份，精密称定，按“2.3.2”项下确定的方法制备供试品溶液，0.45μm 微孔滤膜过滤至液相小瓶中，放置于高效液相色谱仪中，每批进样10μL，计算含量，结果见表7，HPLC 色谱图见图7。

表7 金水六君煎物质基准含量测定Tab.7 Determination of reference substances in Jinshui Liujun Decoction

由表7、图7 可知，综合上述结果，考虑到不同批次及产地间含量有所差异，最终确定金水六君煎物质基准中每克含橙皮苷含量不得少于5.0mg。

图7 15 批金水六君煎物质基准的橙皮苷含量考察色谱图Fig.7 Determination of hesperidin in 15 batches of Jinshui Liujun Decoction

3 结论

本文建立RP-HPLC-UV 的方法对经典名方金水六君煎中橙皮苷的含量进行测定，通过方法学验证，结果证明，该方法准确稳定，操作便捷，为经典名方金水六君煎的下一步成型工艺及质量标准研究奠定基础，有利于促进中医药文化繁荣进步。但陈皮中含有复杂的物质，本文的研究只针对陈皮中单一成分进行测定，对其他成分的研究有待进一步开发，探索中医药之路深远而复杂，需要我们认真研究，为弘扬中医药文化献力。