基于网络药理学的丹参治疗哮喘作用机制初探△

李凡，刘久石，李斌，齐耀东，张本刚，刘海涛，肖培根

中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所 中草药物质基础与资源利用教育部重点实验室，北京 100193

哮喘是由嗜酸性粒细胞、肥大细胞等多种细胞和细胞组分参与的气道慢性炎症[1]，具有气道炎症、气道高反应性和气道重塑等特征[2]。其病理机制复杂、发病急、病程长、难以根治。寻找疗效好且安全性好的药物对于哮喘的治疗十分重要。中医药治疗哮喘历史悠久、临床疗效良好、并发症少且安全性好，在治疗哮喘方面有独特的优势。

丹龙口服液是2017 年我国首个获批上市的中药新药，也是我国实行药品上市许可人制度后第一个获批上市的中药新药[3]。该药以中医辨证论治为原则，由丹参、炙麻黄、地龙等组成[4]，是首个以丹参作为君药治疗哮喘的中成药，表明丹参在治疗哮喘方面具有重要功效。丹参用于肺部疾病治疗早有研究，中西医汇通学派的代表人物张锡纯[5]在《医学衷中参西录》中提出，丹参配伍的中药组方可治疗肺痈等。现代药理研究发现，丹参可通过肿瘤坏死因子样凋亡弱诱导因子/成纤维细胞生长诱导因子14（TWEAK/Fn14）和转化生长因子β1/Smads（TGF-β1/Smads）信号通路[6]、核转录因子-κB（NF-κB）通路[7]等改善卵白蛋白（OVA）诱导的小鼠哮喘炎症。丹龙定喘汤可抑制哮喘小鼠血清中基质金属蛋白酶9（MMP-9）、金属蛋白酶组织抑制因子-1（TIMP-1）的表达，改善气道重塑[8]。临床数据也显示，采用丹参注射液联合曲安奈德对支气管哮喘急性发作期患者进行治疗，总有效率达77%，治疗效果较好[9]；使用丹参川芎嗪辅助治疗支气管哮喘30 例效果显著，能有效减少支气管哮喘复发[10]，提示丹参是治疗哮喘的有效药物。目前，丹参治疗哮喘的药效物质基础及药理作用机制尚不明确，本研究运用网络药理学方法构建丹参治疗哮喘的药物-成分-靶点-通路网络，运用分子对接技术加以验证，模拟化合物与靶点的相互作用，对结合模式和结合能力进行预测，研究关键靶点与丹参主要化学成分之间的相互作用，初步揭示丹参治疗哮喘的活性成分、作用靶点和机制。

1 材料与方法

1.1 丹参活性成分及靶点筛选

利用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）[11]检索丹参的化学成分，以药动学中吸收、分布、代谢和排泄（ADME）属性口服生物利用度（OB）≥30%及类药性（DL）≥0.18作为筛选条件[12-14]，对丹参成分进行初筛以获得活性化合物，进一步获取其对应的靶标蛋白。借助UniProt 数据库（https://www.uniprot.org/）进行靶点蛋白和基因信息校正，获得丹参主要成分的预测靶点。

1.2 哮喘靶点筛选

以“asthma”作为检索关键词，利用GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://www.omim.org/）、TTD（http://systemsdock.unit.Oist.jp/iddp/home/index）、DrugBank（http://www.drugbank.ca/）、DisGeNET（https://www.disgenet.org/）数据库收集哮喘靶点。在GeneCards 数据库中取Score＞中位数的靶点作为哮喘的潜在靶点。合并疾病数据库靶点，在UniProt 数据库中校正基因信息，经过检索和校对去重后确定哮喘的潜在靶点。

1.3 交集靶点蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建

为明确丹参靶点与哮喘潜在靶点间的相互作用，运用R 语言将两者靶点取交集，获得丹参治疗哮喘的靶点，提交至STRING 11.0 在线平台（https://string-db.org/），选择物种为“Homo sapiens”，设定聚类方法为“kmeans clustering”，运用Cytoscape 3.5.1分析得到PPI 网络。运用Cytoscape 3.5.1 中的MCODE插件对网络中各节点进行计算和分析，包括邻节点子图（neighbors）、密度（density）、以该点为种子节点所扩展出的最大值的K-core等信息，得到按照Score排序的4个功能模块。运用CytoHubba筛选得到度（degree）值排名前10的关键靶点。

1.4 功能与通路的富集分析

基于Metascape在线平台（https://metascape.org/gp/index.html）对丹参治疗哮喘的靶点进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）及基因本体（GO）分析，运用R语言对结果进行可视化分析。

1.5 丹参成分-靶点-通路网络的构建

将丹参活性成分、治疗哮喘的靶点及信号通路导入Cytoscape 3.5.1 平台，构建丹参成分-靶点-通路网络。其中，丹参活性成分、靶点、信号通路在网络中以节点（node）表示；各节点之间的相互关系以边（edge）表示。

1.6 丹参治疗哮喘关键靶点的分子对接验证

运用分子对接技术模拟化合物与靶点的相互作用，对结合模式和结合能力进行预测。利用MOE 2019和PyMol 软件对获得的主要靶点和主要的活性成分进行分子对接，验证关键靶点与丹参主要化学成分之间的相互作用。通过PDB 数据库（https://www.rcsb.org）筛选靶点的蛋白晶体结构，选择物种为“Homo sapiens”，实验方法为“X-RAY DIFFRACTION”，高分子实体类型为“Protein”，选择较低分辨率的蛋白晶体作为对接的模板。在PubChem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）中下载丹参活性成分的2D 结构（mol2 格式）。将靶点与活性成分导入MOE 2019 软件，进行预处理和对接位点寻找，之后进行分子对接。运用R 语言绘制对接结果热图，用PyMol软件显示对接结果。

2 结果

2.1 丹参活性成分及靶点

通过TCMSP获得丹参化学成分及对应的靶标蛋白，并运用UniProt数据库将得到的靶标蛋白转换为基因名。剔除无对应的靶点信息后，得到59 个潜在的活性成分（表1），进一步筛选得到其对应的135个可能靶点。

表1 丹参主要活性成分

续表1

2.2 哮喘靶点

从GeneCards 数据库获得哮喘靶点5974 个。设定Score＞中位数的目标靶点为哮喘的潜在靶点，其中Score 最大值为73.99，最小值为0.17，中位数为0.94，故设定Score≥0.94的靶点为哮喘的潜在靶点。剔除数据后，得到3298 个靶点。从OMIM、TTD、DrugBank、DisGeNET 数据库中分别获得哮喘靶点36、147、11、1312 个。合并所有哮喘靶点后删除重复值，在UniProt平台上校正疾病基因名，最终获得3824个哮喘靶点。

2.3 交集靶点PPI网络

将筛选的丹参成分靶点与哮喘靶点取交集，通过R 语言绘制韦恩图，得到丹参成分-哮喘共同靶点108 个（图1A）。将靶点提交至STRING 11.0 平台，运用Cytoscape 3.5.1 软件处理得到丹参靶点PPI 网络（图1B）。Jun、前列腺素E2（PTGS2）、信号转导和转录激活因子3（STAT3）、蛋白激酶B1（Akt1）、白细胞介素-6（IL-6）等结合分数都较高且度值较大，表明这些靶点可能在丹参治疗哮喘中起关键作用。获得PPI 网络后，利用Cytoscape 3.5.1软件中的MCODE 插件对相互作用关系进行聚类分析，得分值最高的子网络，见图1C。利用CytoHubba 插件得到按照度值排名前10 的关键基因（图1D），依次为Akt1、表皮生长因子受体（EGFR）、Fos、IL-6、Jun、丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、PTGS2、肿瘤坏死因子（TNF）、肿瘤蛋白p53（TP53）、血管内皮生长因子A（VEGFA）。

图1 丹参治疗哮喘靶点PPI分析

2.4 靶点功能与通路的富集分析

将丹参治疗哮喘的靶点信息导入Metascape平台进行KEGG 信号通路分析和GO 分析，并用R 语言绘制结果图（图2）。依据P＜0.01、涉及靶点数量≥3、富集因子＞1.5，筛选出关键的20 条通路（图2A）。结果显示，丹参治疗哮喘的靶点富集通路主要集中在磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-Akt、NF-κB、Janus激酶-STAT（JAK-STAT）等通路，提示这些经典通路可能在丹参治疗哮喘中发挥着重要作用。

设定相同的筛选条件得到GO 分析结果。GO 分析表明，丹参通过作用体内的多个位置和多种生物学过程发挥治疗哮喘的作用。细胞组分（CC）分析表明，靶点的产物可能主要在细胞膜的功能筏（membrane raft）、突触后膜（postsynaptic membrane）等部位（图2B）；分子功能（MF）分析表明，靶点可能是通过G 蛋白偶联胺受体（G protein-coupled amine receptor activity）、神经递质受体的活动（neurotransmitter receptor activity）等发挥作用（图2C）；生物学过程（BP）分析则提示，细胞因子介导的信号通路（cytokine-mediated signaling pathway）在丹参治疗哮喘中比较重要（图2D）。

图2 丹参治疗哮喘交集靶点的KEGG及GO分析（排名前20位）

2.5 药物-成分-靶点-通路网络

以上述得到的丹参治疗哮喘的59 个潜在成分、108个交集靶点与20条关键通路为基础，构建“network”与“type”文件，输入至Cytoscape 3.5.1构建药物-成分-靶点-通路网络。如图3所示，丹参通过59个成分、108个靶点、20条关键通路协同调控治疗哮喘。

图3 丹参治疗哮喘的药物-成分-靶点-通路网络

2.6 分子对接验证

将上述实验筛选出的3 个主要活性成分木犀草素、丹参酮ⅡA、隐丹参酮与10 个关键靶点Akt1、EGFR、Fos、IL-6、Jun、MAPK1、PTGS2、TNF、TP53、VEGFA进行分子对接验证。结果表明，参与分子对接化合物打分值均为负数（表2），打分值大多＜-5，表明化合物与关键靶点之间有较好的结合力。隐丹参酮可与PTGS2 的Tyr385、Ser530 2 个氨基酸残基作用（图4A），打分值为-7.382 5；丹参酮ⅡA与MAPK1 的Ile31、Met108、Asp106、Gln105残基相互作用（图4B），打分值为-5.408 9；木犀草素可以与EGFR（Met793、Gln791、Met790、Lys745、Asp837，图 4C）和 PTGS2（Tyr385、Ser530，图4D）相互作用，打分值分别为-7.167 1、-7.211 0。分子对接结果提示，丹参重要活性成分与疾病靶点生物亲和力高，具有良好的活性。

图4 丹参有效成分与靶点部分分子对接结果

表2 丹参有效成分与靶点对接打分

3 讨论

本研究采用网络药理学的方法分析并探讨丹参治疗哮喘的活性成分、关键靶点和信号通路，并基于分子对接初步模拟其可能分子作用机制。气道炎症和气道重塑是哮喘的2 个主要病理学特征。本研究发现，丹参可通过影响气道重塑和缓解气道炎症发挥治疗哮喘的作用。丹参主要含脂溶性的丹参酮类及水溶性的黄酮类化合物[15]，本研究结果表明，丹参中59 个化学成分可通过作用于108 个靶点与20 条信号通路在治疗哮喘发挥作用。隐丹参酮和丹参酮ⅡA均是丹参中主要的脂溶性丹参酮类成分，属二萜醌类。隐丹参酮可降低哮喘小鼠气道周围炎性细胞浸润和辅助性T 细胞2（Th2）细胞因子分泌，从而改善哮喘[16]。丹参酮ⅡA可降低血栓素B2等表达，缓解支气管平滑肌收缩和血小板聚集，通过调节微循环障达到缓解哮喘的效果[17]。木犀草素是丹参中主要的黄酮类化合物，可抑制IL-4、IL-5、IL-13 等Th2 型细胞因子的合成，减少炎性细胞浸润，减轻哮喘炎症继而缓解哮喘症状[18-19]。隐丹参酮、丹参酮ⅡA和木犀草素3 个化合物通过Akt1、EGFR、Jun、IL-6、Fos 等10 个关键靶点介导PI3KAkt、NF-κB、JAK-STAT 3 个关键通路参与调控哮喘（图5）。

图5 丹参治疗哮喘的作用机制

PI3K-Akt 信号通路是与细胞内与磷脂酰肌醇有关的通路[20]，可参与调节哮喘。Akt1 是PI3K 直接作用的下游靶点，木犀草素可通过抑制Akt1 的磷酸化介导PI3K-Akt 信号通路，减少小鼠气道平滑肌增殖从而缓解哮喘[21]。

NF-κB 通路被激活后可促进与哮喘有关的多种炎症因子的基因转录，导致炎症反应，诱发哮喘发病或加重哮喘症状。隐丹参酮可能通过TNF 等靶点影响NF-κB 抑制剂-α（NFKBIA）、p65 NF-κB 的磷酸化和TLR4 的表达而抑制NF-κB 通路，使肺组织中巨噬细胞和嗜中性粒细胞浸润增加得到抑制，并减弱过氧化物酶（MPO）活性[22]。丹参酮ⅡA可通过NFKBIA 等抑制TNF-α、TLR4和NF-κB mRNA 和蛋白的表达，通过抑制TLR4/NF-κB 通路减轻炎症损伤，从而减轻哮喘炎症[23]。

JAK-STAT通路是细胞因子受体介导的通路，被认为与支气管哮喘有关[24-25]。IL-6 是支气管哮喘的主要炎症因子，哮喘急性发作时，IL-6 作用于B 细胞和T 细胞，促进免疫球蛋白E（IgE）生成[26]；IL-6与受体结合后也可活化JAK1，通过磷酸化STAT3，激活JAK-STAT 通路，引发炎症反应，导致支气管平滑肌痉挛和气道炎症。木犀草素等可降低IL-6 的表达，减少IgE 生成并进一步阻碍STAT3 活化，通过抑制JAK-STAT 通路达到改善肺部炎症、缓解支气管平滑肌痉挛、缓解哮喘的效果。

丹参中的丹参酮ⅡA和木犀草素还可通过降低肺组织中MMP-9 水平，减少大鼠肺组织炎性细胞浸润，减轻支气管管壁和平滑肌增生程度，改善气道重建[27]。MMP-9 是与哮喘关系密切的基质金属蛋白酶，可特异性降解细胞外基质，使其结构重建，同时诱导嗜酸粒细胞迁移并影响气道平滑肌细胞增殖与迁移，进而诱发哮喘气道重建。木犀草素还可抑制白细胞介素-13受体α2（IL-13Ra2）的表达，从而抑制气道壁的增厚和平滑肌增殖，减轻气道重塑[28]。此外，丹参酮ⅡA、木犀草素等还可通过下调哮喘肺组织中的Fos[29]、Jun[30]、EGFR[31]的表达以拮抗气道重塑、调控气道上皮细胞功能、改善气道上皮细胞对损伤和修复、缓解哮喘气道炎症。

最后，分子对接结果显示，木犀草素、隐丹参酮和丹参酮ⅡA与Akt1、EGFR 等关键靶点之间有较好的结合力，提示丹参重要活性成分与疾病靶点生物亲和力强，在哮喘治疗方面具有潜在的药理活性。

4 结论

本研究利用网络药理学的方法构建丹参治疗哮喘的成分-靶点-通路网络，提示丹参通过多成分、多靶点、多通路的方式治疗哮喘，并基于分子对接初步模拟其可能的分子作用机制。结果发现，丹参59 个潜在的有效成分通过108 个靶点、20 条主要通路发挥治疗哮喘的作用。其中3 个重要化合物通过与10 个关键靶点相互作用，介导3 条重要通路在治疗哮喘中发挥重要作用。隐丹参酮通过作用于TNF、TLR4 等靶点介导NF-κB 通路，减轻哮喘气道炎症；丹参酮ⅡA主要通过NFKBIA 等抑制TNF-α和NF-κB表达，进而抑制NF-κB 通路，减轻炎症损伤和治疗哮喘；木犀草素主要通过Akt1、IL-6 和STAT3 等靶点影响PI3K-Akt和JAK-STAT 通路，缓解气道炎症、改善气道重塑和免疫调节来治疗哮喘。最后通过分子对接验证三者与疾病靶点生物亲和力高，具有良好的药效活性，为后续实验研究提供参考。