腐烂病菌、溃疡病菌侵染早期新疆杨叶片组织光合响应特征的比较*

邢军超 张一南 石 焱 李金鑫 李 敏 申宛娜 王 黎 赵嘉平

(1.中国林业科学研究院林业新技术研究所 北京 100091； 2.国家林业和草原局管理干部学院 北京 102600；3.中国林业科学研究院林业研究所 北京 100091)

全球气候变暖变化背景下，干旱、高温以及辐射等非生物胁迫对树木生长产生影响(Bernaletal.， 2015； Ruehretal.， 2016； Saikietal.， 2017)，而目前与气候相关的林木病原菌、害虫以及其他森林有害生物对树木影响的研究相对匮乏。杨树(Populus)腐烂病和溃疡病是分别由弱寄生性菌污黑腐皮壳菌(Valsasordida)和葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)引起的枝干真菌病害，这2种林木病害对于我国的杨树人工林造成了严重的破坏(吕全等， 2003； 梁军等， 2003)。杨树腐烂病和溃疡病的病原物生物学特性、病害的侵染流行与监测、寄主植物与病菌互作的分子机制等已有大量研究(吕全等， 2003； 梁军等， 2003)，而对病害发生的病理生理学机制研究较少。

光合作用是植物最重要的生理过程之一，干旱、高温、盐以及病害等逆境胁迫下植物光合作用会显著降低、生长放缓甚至出现植物死亡现象(Reddyetal.， 2004； Moradietal., 2007； Clemenzetal.， 2008； Mathuretal.， 2014)。树木溃疡类病害虽然主要发生于枝干韧皮部并最终在侵染点周围形成坏死性病斑，但同时溃疡类病害也通常会造成林木冠层枝枯、枯萎以及死亡(吕全等， 2003； 梁军等， 2003)。枝干溃疡类病害显著改变寄主植物的光合特征(Rohrs-Richeyetal.， 2011； Cerqueiraetal.， 2017)，枝干溃疡病菌(Quambalariacoyrecup)侵染美叶桉(Corymbiacalophylla)后期(110～140 天)，叶片净光合速率与气孔导度均显著降低(Hossainetal.， 2019)。笔者课题组前期研究表明溃疡病菌、腐烂病菌侵染中后期(20、25、30 天)，新疆杨叶片净光合速率和气孔导度显著下降(Lietal., 2019)。但也有研究表明，在黑腐皮壳属真菌(V.melanodiscus)菌株侵染早期(2周前)，寄主植株阿拉斯加矮桤木(Alnusfruticosa)出现光合速率上调的现象(Rohrs-Richeyetal.， 2011)。因此，深入研究树木枝干溃疡类病菌与寄主植物的光合及气体交换特征的关系仍然具有重要的病理生理学意义。

新疆杨(Populusalbavar.pyramidalis)属白杨派，为我国西北地区优良的绿化和防护林树种，并作为防护林首选树种广泛栽培于我国西北干旱地区。林间调查发现，杨树枝干病害尤其是新疆杨、胡杨(Populuseuphratica)等杨树的腐烂病害在我国内蒙古、宁夏、新疆等省区以及东北地区普遍发生且危害严重。本研究采用杨树腐烂病、杨树溃疡病试验体系，通过对病菌侵染早期新疆杨光合作用及气体交换特征、叶绿素荧光等特征的分析，拟阐明基于光合作用的杨树腐烂病、杨树溃疡病的病理生理学机制，并揭示2种病害病理生理学机制的差别。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1年生新疆杨扦插苗于中国林业科学研究院科研温室栽培生长30天，转移至含有混合基质(草炭土∶ 珍珠岩=6∶1)的塑料花盆(上径19 cm ×下径17 cm ×高21 cm)中，培养于中国林业科学研究院林业新技术研究所植物生理研究室试验地。 腐烂病菌V.sordida菌株CZC(NCBI登录号： rRNA-ITs序列，MK994101； EF1α基因，MN025273)和溃疡病菌B.dothidea菌株CZA(NCBI 登录号: rRNA-ITs序列，MK990559； EF1α 基因，MN025271)(Lietal.， 2019)保存于中国林科院林业新技术研究所植物生理实验室。菌株活化后于PDA培养基(pH6.0)、25 ℃黑暗培养7天后接种新疆杨。

1.2 试验设计

笔者前期实验证明，表皮环割对照与未处理对照对新疆杨光合及气体交换特征、叶绿素荧光指标以及非结构性碳水化合物含量等特征没有影响，为简化试验体系，本研究设置2个不同处理，分别为表皮环割接种V.sordida(Vso)、表皮环割接种B.dothidea(Bdo)，并以表皮环割接种PDA(Ctrl)作为对照。20株1年生新疆杨健康植株随机分为2组，测定各组植株的初始光合指标，于第2天上午9：00开始接种处理。接种时，预先用75%酒精对接种点进行灭菌处理，然后用锋利刀片沿新疆杨植株茎干距基部30 cm处轻轻切掉一层外表皮，使其露出浅绿色的韧皮部。再将在PDA培养基上培养好的病原菌菌丝体切成1 cm宽的菌块，菌丝体面向韧皮部，沿植株切口环绕一周，去除多余菌块，最后用封口膜缠绕使其固定。本试验采用空白PDA培养基接种作为对照，其余均与接种处理相同。选取每株幼苗自顶部向下第4～6片健康成熟叶，测定接种后0、3、5、7和9天的气体交换指标和叶绿素荧光指标。试验期间每天18:00—19:00灌水，保证所有植株充分灌水。

1.3 测定指标

1.3.1 光合指标测定 选择晴朗无云的天气，采用Li-6400XT便携式光合测定系统分析仪(LI-COR，Lincoln，USA)测定苗木在不同处理下的净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)、胞间CO2浓度(Ci)等光合特性指标。测定时采用LED红蓝光源，光合有效辐射(PAR)设定为1 500 μmol·m-2s-1，环境CO2浓度为400 μmol·mol-1左右，气体流速设定为500 μmol·s-1。测定时间为上午9:00—11:00，处理及对照均为7个生物学重复。

根据测定结果，计算水分利用效率(WUE)和气孔限制值(Ls)。具体计算公式如下：

水分利用效率： WUE=Pn/Tr；

气孔限制值：Ls=1-Ci/Ca。

式中，Ca为空气中CO2浓度。

电子传递速率： ETR=ΦPSⅡ×0.5×0.84；

1.4 数据处理与分析

采用R3.5.0进行数据统计以及数据可视化分析，处理与对照之间的差异采用独立样本T检验，显著差异检验水平为P<0.05，极显著差异检验水平为P<0.01，各项统计数据均为平均值±标准误差表示。本研究对Gs、Ci与Pn作相关性分析，Pn与Gs相关性分析采用非线性回归拟合(Lpezetal.， 2015)，其他参数之间的相关性采用线性回归拟合，相关性分析采用Pearson相关系数。

2 结果与分析

2.1 光合作用与气体交换指标

腐烂病菌接种后3～9天，新疆杨叶部净光合速率(Pn)和气孔导度(Gs)(3～9天)显著降低，造成胞间CO2浓度(Ci)的显著升高(接种后3～7天)； 除第9天外，腐烂病菌接种显著降低气孔限制值(Ls)(P<0.05)(图1)，说明腐烂病菌主要以非气孔限制方式抑制新疆杨光合速率。溃疡病菌接种处理显著降低新疆杨叶片Pn和Gs(接种3～9天)，Ci(接种5～7天)，但显著升高Ls(接种3～9天)(P<0.05)(图2)，该结果说明气孔因素是溃疡病菌胁迫下新疆杨Pn降低的主要原因。

图1 腐烂病菌胁迫对新疆杨光合特征的影响Fig.1 The photosynthetic characteristics of P. alba var. pyramidalis infected by pathogen V. sordida(Vso)A： 净光合速率(Pn)； B： 气孔导度(Gs)； C： 胞间CO2浓度(Ci)； D： 气孔限制值(Ls)。A: Net photosynthetic rate(Pn); B: Stomatal conductance(Gs); C: Intercellular CO2 concentration(Ci); D: Limiting value of stomata(Ls).

图2 溃疡病菌胁迫对新疆杨光合特征的影响Fig.2 The photosynthetic characteristics of P. alba var. pyramidalis infected by pathogen B. dothidea(Bdo)

2.2 蒸腾速率和水分利用效率

腐烂病菌接种显著降低新疆杨叶片的蒸腾速率(Tr)(接种后5～7天)和水分利用效率(WUE)(接种3～7天)(P<0.05)。溃疡病菌胁迫下新疆杨Tr显著下降(P<0.05)，但其降幅(40%～57%)远小于腐烂病菌对新疆杨Tr的抑制作用(71%～82%)； 并且溃疡病菌侵染对新疆杨WUE没有影响(接种后3～9天)(P>0.05)(图3)，说明溃疡病菌侵染并未对新疆杨水分利用效率造成不利影响。

图3 病菌胁迫对新疆杨蒸腾速率和水分利用效率的影响Fig.3 The effects of pathogen inoculations on transpiration rate and water use efficiency of P. alba var. pyramidalisA和C表示腐烂病菌胁迫下的蒸腾速率(Tr)及水分利用效率(WUE)； B和D表示溃疡病菌胁迫下的蒸腾速率(Tr)及水分利用效率(WUE)。 A and C respectively represent transpiration rate(Tr) and water use efficiency(WUE) under the stress of V. sordida(Vso).Band D respectively represent Tr and WUE under the stress of B. dothidea (Bdo).

2.3 叶绿素荧光指标

腐烂病菌侵染下，新疆杨叶片最大光化学效率(Fv/Fm)显著降低19.5%～41.2%(P<0.01)，叶片PSⅡ实际光化学效率(ΦPSⅡ)下降22.0%～62.5%(P<0.001)，电子传递速率(ETR)下降50.4%～63.4%(P<0.001)(图4)，这表明腐烂病菌可能通过对光合链电子传递进程的抑制改变光合作用速率。此外，腐烂病菌侵染下，植株光化学淬灭系数(qp)下降21.2%～56.0%(P<0.001)，说明胁迫条件下新疆杨叶片天线色素捕获的光能用于光合碳同化的份额减少。

图4 腐烂病菌胁迫对新疆杨叶绿素荧光特征的影响Fig.4 The chlorophyll fluorescence characteristics of P. alba var. pyramidalis infected by pathogen V. sordidaA： 最大光化学效率(Fv/Fm)； B： 实际光化学效率(ΦPSⅡ)； C： 电子传递速率(ETR)； D： 光化学淬灭系数(qp)。数据为7次重复的平均值±标准误。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，P值表示显著性差异水平。下同。A: The maximum photochemical efficiency(Fv/Fm); B:Actual photochemical efficiency(ΦPSⅡ); C: Electron transport rate(ETR); D:Photochemical quenching coefficient(qp).Data are the mean± standard error of 7 replicates.*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.The P-value represents the level of significant differences.The same below.

图5 溃疡病菌胁迫对新疆杨叶绿素荧光特征的影响Fig.5 The chlorophyll fluorescence characteristics of P. alba var. pyramidalis infected by pathogen B. dothidea

溃疡病菌接种造成新疆杨叶片Fv/Fm、ΦPSⅡ、ETR和qp显著降低(接种后3～9天)(P<0.01)(图5)。然而，与对照相比，Fv/Fm降幅很小(约为1%)，且始终维持在Björkman等(1987)提出的健康植株的阈值范围内(0.75～0.85)。此外，溃疡病菌降低新疆杨叶片PSⅡ实际光化学效率(ΦPSⅡ)12.5%～29.4%，降低电子传递速率(ETR)16.2%～29.5%，降低光化学淬灭系数9.7%～22.0%，但其降幅均小于腐烂病菌的抑制作用，表明腐烂病菌对新疆杨叶片光合机构的损伤更为严重。

2.4 病原真菌胁迫下新疆杨光合指标之间的相关性

腐烂病菌和溃疡病菌胁迫下新疆杨叶片Pn与Gs均呈显著非线性正相关(图6A、B)。溃疡病菌胁迫下Ci与Pn表现为线性正相关(图6D)； 然而，腐烂病菌处理下Pn与Ci不具线性相关(图6C)。回归分析显示，溃疡病菌处理植株、2个对照组植株的Gs与Ci指标呈线性正相关，其回归曲线的斜率几乎相同(0.002和0.003)，显示溃疡病菌侵染不改变感病新疆杨植株的Gs-Ci关系，因此，Ci随Gs的降低而降低。腐烂病菌处理植株的Gs水平极低(0.02～0.09 mmolH2O·m-2s-1)，但Ci水平异常增加(350～420 μmolCO2·mol-1)并显著超过未受胁迫植株，回归分析表明Ci与Gs无关(图7)，即腐烂病菌显著改变了感病新疆杨植株的Gs-Ci关系。

图6 叶片气孔导度和胞间CO2浓度与净光合速率的相关性Fig.6 Correlations between leaf stomatal conductance, intercellular CO2 concentration and net photosynthetic rateA和C表示腐烂病菌胁迫下净光合速率与气孔导度以及胞间CO2的相关性； B和D表示溃疡病菌胁迫下净光合速率与气孔导度以及胞间CO2的相关性。A and C respectively represent the correlations between leaf stomatal conductance(Gs), intercellular CO2 concentration(Ci) and net photosynthetic rate (Pn)under the stress of V. sordida. B and D respectively represent the correlations between leaf stomatal conductance(Gs), intercellular CO2 concentration(Ci) and net photosynthetic rate(Pn) under the stress of B. dothidea.

图7 叶片胞间CO2浓度与气孔导度之间的相关性Fig.7 Correlations between leaf intercellular CO2concentration and stomatal conductance

3 讨论

光合作用是植物最为重要的生理进程之一，其速率、强度受到内外环境因素的精密调控。气孔是植物叶部组织表面的气体和水分交换的通道，气孔开度直接影响CO2的摄入，进而影响胞内组织的CO2浓度以及光合作用速率(Lawsonetal., 2019)。除此之外，植物光系统的生化活性(Niuetal.， 2014)、叶片叶肉导度(Flexasetal.， 2004； Galleetal.， 2009； Nogueira Júnioretal.， 2017)等均会影响光合反应底物的浓度并进而改变光合作用速率，因此，植物光合作用速率受到气孔及非气孔2种因素的制约(Stewartetal.，1995)。进一步研究表明，逆境胁迫(如干旱、盐胁迫)对植物光合作用的抑制存在由气孔限制向非气孔限制类型转换的现象(惠红霞等， 2004； 付士磊等， 2006)。光合速率受气孔限制还是非气孔限制，取决于胞间CO2浓度(Ci)和气孔限制值(Ls)变化的方向，并且主要依赖于Ci的变化方向(Farquharetal., 1982)。本研究中，溃疡病菌处理引起Pn、Gs、Ci下降，而Ls上升(图2)，因此，气孔因素可能是溃疡病菌胁迫下新疆杨光合速率降低的主要原因。在腐烂病菌中，Pn、Gs下降的同时，由于Ci增加，Ls下降(图1)，因此，腐烂病菌胁迫下新疆杨叶片光合速率降低的主要原因为非气孔因素。

植物病害中，病原真菌等通过分泌毒素或者次生代谢产物调节气孔开度(Heiseretal.，1998)，然而病菌影响胞间CO2浓度的报道较少。病原真菌通常表现为气孔关闭活性(Hossainetal.， 2019； Wilmer， 1996)。作为CO2摄入的通道，气孔关闭导致胞间CO2浓度的降低(Pradhanetal.， 2015)，但也有研究表明病菌侵染增加Ci(Nogueira Júnioretal.， 2017； Zhaoetal.， 2011)，或者不影响寄主植物叶片的Ci(Yinetal., 2018)。在干旱胁迫下，随着Gs的降低，叶片Ci显著降低； 当Gs达到极低水平时，最大光化学效率Fv/Fm快速降低，显示叶部光合作用受到强烈的非气孔限制，最终Ci随着Gs接近最小值而增加，这可能是不可逆光抑制的开始(Brodribb,1996)。有研究表明，病原真菌会破坏或者抑制Rubsico酶活性，降低Pn并同时造成胞间CO2的积累(Muthuchelianetal.， 2005)。本研究中，腐烂病菌侵染植株的Gs处于极低水平，显示气孔接近完全关闭； 与此同时，Fm/Fv和ΦPSⅡ显示叶肉组织光合活性受到显著抑制(图4)，因此，腐烂病菌对光系统Ⅱ的不可逆抑制以及对Rubsico酶活性的抑制可能是导致胞间CO2增加的主要原因。

叶绿素荧光参数是评价植物叶片光合机构是否受损的重要指标。相比光合指标，叶绿素荧光指标可以更灵敏地反映光合机构的健康状况(Björkmanetal., 1987； Krauseetal., 1991)。有研究认为最大光化学效率Fv/Fm为0.75～0.85可以作为植物健康或者未受到生物胁迫的标志(Björkmanetal., 1987)。本研究中，腐烂病菌侵染显著降低新疆杨Fv/Fm(图4A)，说明新疆杨受到腐烂病菌胁迫。溃疡病菌胁迫下，虽然Pn、Gs、Tr、Ci以及ETR、ΦPSⅡ、qp等指标的显著下调(图2； 图4)表明新疆杨正在遭受溃疡病菌胁迫，但Fv/Fm降幅极小(约为1%)，仍然处于未接种健康植株的Fv/Fm值区间。本研究结果表明，最大光化学效率Fv/Fm为0.75～0.85并不能作为植物未受到环境胁迫的确切标准，或者至少不能作为判断气孔限制类型病害或者处于气孔限制阶段的植物病害发生的确切标准。

4 结论

最大光化学效率Fv/Fm并不能准确反映植物遭受的所有生物胁迫，Fv/Fm为0.75～0.85不能作为植物未受到环境胁迫的确切标准。杨树腐烂病、溃疡病发生早期，新疆杨气体交换及叶绿素荧光参数特征具有显著差别。相比较于溃疡病菌，腐烂病菌胁迫对新疆杨光合作用具有更大的抑制作用，腐烂病菌显著降低而溃疡病菌胁迫不改变新疆杨叶片水分利用效率，这可能是腐烂病害比溃疡病害更易于在干旱地区发生以及在该地区腐烂病害危害更为严重的重要生理原因。