植物叶片扫描电镜样品不同处理与观察方法的研究进展

刘 乐 王文可

（河南师范大学生命科学学院 河南新乡 453007）

扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscope，SEM） 自1973年[1]开始用于观察植物叶表皮的微观形态。大多数SEM 成像是利用高真空下的二次电子探测器处理，得到植物的器官，特别是表面结构如毛状体、气孔、保卫细胞等的伪三维图像[2]。比起运用光学显微镜进行植物样品的观察，SEM 可以观察到更加细微的结构特征，更清晰地展示出植物表面的微形态特征，从而对未知植物进行鉴定[3-4]。现阶段对植物叶片样品的处理方式有多种，文章主要对叶片处理过程中固定、脱水置换、干燥及样品观察的不同研究方法进行了归纳比较，并对相关研究进展进行讨论，为研究者有效地进行SEM 叶片制样及观察提供一些有用信息。

1 SEM 叶片样品制样要求

样品的预处理对后期观察效果有一定影响，若是处理叶片的方法不当，叶片很大可能会产生皱缩，影响叶片形态结构的观察与分析。在进行SEM 植物叶片样品的制备时，应满足以下要求：（1）样品的导电性好，不会产生荷电效应[5]；（2）样品要尽可能处于干燥状态，若样品中有水分，水分挥发会造成图像模糊、损坏电镜部件等；（3）样品的热稳定性好，避免分解释放的气体或其他物质污染仪器；（4）样品不能具有磁性[6]。

2 SEM 叶片样品的处理

2.1 不同固定方式对样品成像的影响

大部分植物叶片在脱水前需要进行固定处理。经过固定的样品，在脱水及导电处理等后期制样时，样品的结构不易改变，更易保持原有叶片的形态[7]。固定时需要根据植物叶片的特点和观察要求，选择合适的固定液。对于不同的样品材料，其固定处理有多种不同的方式。目前，在对植物叶片固定处理中，选用较多的方法是运用戊二醛、FAA、锇酸、卡诺固定液、甲醇等固定。

在固定液的选取上，戊二醛固定液与戊二醛—锇酸双固定液相比，双固定液的效果更优，但效果差异不明显[8]。对一些较容易固定液或不容易变形的材料，从降低实验成本考虑，可使用戊二醛进行单固定。在戊二醛单固定处理生物样品时，利用超声和微波处理，可以改善用戊二醛单固定效果的缺陷[9]。除此之外，固定液的选择也会影响最终叶片样品的形态饱满度，运用戊二醛或FAA 固定会导致样品的大面积收缩[10]。经过甲醇固定处理的样品，效果要优于传统的戊二醛作为固定液[11]。与其他溶剂型和水性固定方法相比，甲醇固定和脱水以及随后的乙醇脱水能够更好地维持样品表面形貌和组织尺寸[12]。甲醇固定逐渐被大多数研究者选用，其中以甲醇浸泡10 min 并在临界点干燥保存各种植物的组织形态为宜[13]。

固定液浓度的选取很大程度取决于叶片样品的含水量和幼嫩程度。例如在对月季花瓣固定液浓度的探索中[14]，研究者分别对浓度为2.5%、5%、7.5%、10%、15%、20%的戊二醛溶液的固定效果进行了比较。过低或过高浓度的戊二醛溶液处理柔嫩、含水量高的叶片时（4 ℃中固定4 h），绝大多数叶片表面失水严重，导致表面形态观察不清晰。选择适合的浓度进行固定处理，观察效果相对较好，叶片细胞形态相对饱满。在月季花瓣固定处理中，最佳固定液浓度为7.5%。

2.2 脱水置换条件的探索

大部分植物叶片需先进行脱水干燥的处理并镀金，之后才能进行扫描电镜的观察[15]。对于植物叶片样品的脱水置换处理，常用方法是运用梯度乙醇溶液进行脱水，各浓度脱水15 min，之后用叔丁醇置换100%乙醇。在室温下先使用乙醇-叔丁醇溶液置换20 min，再用100%叔丁醇置换30 min，之后用100%叔丁醇重复置换1 次[4]。除此之外，置换过程中省去乙醇-叔丁醇溶液的处理，直接用100%叔丁醇置换3 次也能得到较为理想的结果[16]。

除此之外，研究者在脱水处理前可以采用配制所选固定液对应的缓冲液进行反复清洗，以除去固定液，防止戊二醛和锇酸反应或避免戊二醛和脱水剂（乙醇、叔丁醇）反应，导致产生沉淀而影响固定效果[17]。

3 不同样品干燥方式的比较

在制样过程中，少数植物叶片样品无须干燥处理，可以直接用SEM 进行观察，如黑麦叶片[18]、龙须草[19]、梯牧草等。而大多数植物组织中含有大量水分，在SEM 下，水分的挥发会造成图像漂移，影响实验后期观察，同时对仪器有很大的损害。对样品干燥处理的方法多样，例如自然干燥法[20]、烘干干燥法[21]、临界点干燥法、叔丁醇真空干燥法、硅胶干燥法[22]、叔丁醇一步冷冻干燥法和冷冻干燥法[23]等。

其中自然干燥法无设备条件的限制，简单易行，操作方便，但干燥过程中存在的表面张力会导致样品发生形变[4]，样品表面发生收缩、龟裂或塌陷，仅适用于老叶或含水量较少、细胞壁和蜡质层较厚的植物叶片。烘干干燥法干燥速度较快，操作简便，但叶片可能在干燥后发生形变甚至断裂，嫩叶经处理后发生严重的收缩现象，适用于比较坚硬且耐热的植物叶片，如被子植物叶片[24]。叔丁醇真空干燥可干燥大量样品，相较于冷冻干燥法而言，对样品损伤小，能较好地保持样品原貌[13]，但叔丁醇的凝固点为25.5 ℃，在低温室内即可凝固，不利于后续实验的进行，操作较烦琐，适用于各类型的植物叶片。硅胶干燥法操作迅速、方便，硅胶可回收，经济、简易，可循环利用，可用于野外干燥保存[25]，但含水量较多的植物组织会发生严重的收缩现象，叶片腹面褶皱严重，对样品形态损坏严重，后续回收硅胶步骤比较费时[24]，适于含水量较少的植物组织。叔丁醇一步冷冻干燥法操作简单、方便快捷，叔丁醇在冷冻时固相重结晶的机会少，可减少冰晶对样品的损伤，适用于各类型的植物样品。冷冻干燥法能反映样品真实的微形态特征，但冷冻干燥过程中冷冻和脱水应力会造成植物叶片的损伤，操作需掌握最佳冷冻干燥温度与时间[26]，适用于幼嫩、含水较多的叶片。临界点干燥法能最大限度地还原样品原貌[21]，但操作步骤烦琐，费时费力，需专业仪器设备，且易在干燥过程中损伤植物样品，适用于各类型的植物样品，如苔藓[27]。

4 SEM 图像条件的探讨

SEM 利用的是高能聚焦电子束，通过这一物质来扫描样品表面[28]，收集二次信号[29]以得到可以清晰地显示样品形态、微观结构的高质量图像。在SEM 成像过程中，影响图像质量的因素比较多，例如对样品温度的控制、图像参数的选择、检测器的选择等[30]。

4.1 成像参数的选择

想要获取效果最佳的SEM 图像，需要对影响图像质量的参数进行调节，例如加速电压。研究者可以根据样品的不同特征和观察需要，选取合适的加速电压。加速电压与图像的分辨率相关，在低加速电压下，电子束穿透的深度浅，得到的图像衬度好，可以较为清晰地表现样品表面的微观形貌[31]。适当提高加速电压可以增大二次电子强度，提升图像的清晰度。但如果加速电压过高，电子束的穿透能力会随之增强，扩散区加大，导致二次电子与散射电子发射，甚至会造成二次电子被散射的后果，出现叠加的虚影[31]，导致图像的分辨率下降，无法清楚显示样品表面的微细结构，同时还会减少SEM 仪器灯丝的寿命[32]。

在以禾本科龙须草[19]的叶片为材料进行加速电压的探讨中，研究比较了扫描电镜在不同加速电压（5 kV、10 kV、20 kV）下的观察效果。结果表明，对于龙须草而言，10 kV加速电压条件下观察效果更好。在观察艾叶[20]、桑叶[32]的实验中发现，加速电压范围为5～10 kV 时，SEM 图像效果更好。在观察十字花科双子叶植物[32]，如油菜和白菜时（含水量大于80%），样品制备后，在5～15 kV 的加速电压下图像成像质量较好。

4.2 观察仪器的选择

大部分植物叶片样品中含有大量水分，若不经过前期处理，叶片表面放电严重难以进行观察分析，而且会对仪器造成损伤。而植物样品经过干燥、脱水处理后，很多信息会发生变化。特别是对于观察气孔而言，常规的SEM 制样处理后，叶片的气孔大部分呈现关闭状态，无法观察其特征[33]。随着科学技术的不断发展，SEM 在各方面有了较大的改进，功能越来越齐全[28]。除了常规SEM，还有环境扫描电子显微镜、场发射扫描电子显微镜、冷冻扫描电镜等。

冷台法SEM 观察需配有冷台的SEM，它在样品室内有专门控制温度的设备。冷台法的制样过程简单快速，不需要对样品进行脱水和干燥等处理。只需将植物叶片样品用冷冻胶水固定于样品托上，随后放至电镜的样品舱中的冷台，即可在低温下迅速得到较为清晰的植物表皮图像，从而获取未经过喷金、脱水等处理的叶片表皮信息。前期研究结果表明，冷台设置在较低的冷冻温度有利于样品的稳定性[34]。

使用环境扫描电子显微镜观察时，将样品裁剪成合适大小后便可直接进行观察，简便快捷。但在环境扫描电子显微镜下，部分样品会出现失水严重的现象，图片衬度不理想[28]。

冷冻扫描电镜的操作较简单，最快的情况下5 min 便可观察样品。冷冻扫描电镜仪器具有仪器内温度低、样品冰晶产生少、相对湿度高等特点，从而可以维持样品原貌[13]。使用冷冻扫描电镜观察的植物样品少有塌陷或是皱缩的现象，样品形态大都饱满，表面较为清晰。但由于其价格昂贵，目前还未被普遍使用。

场发射扫描电子显微镜是最近几年研发出的一种表面观测设备，它具有高效、简便的优点，对所观察样品的微观形态伤害极小[35]。同时，场发射扫描电子显微镜具有分辨率高、景深大、图像更有立体感、放大倍数可调范围宽等特点[31]。但其对环境要求较高，样品制备具有一定难度。

5 结语

叶片是植物主要的营养器官之一，植物叶片的观察在鉴定植物种类方面具有非常大的作用。植物的叶表皮特征具有一定的遗传稳定性，叶表皮的微形态特征也能一定程度反映类群间的亲缘关系[36]。目前，无论是利用何种方法进行SEM 样品的前期处理，都无法完全避免细胞的皱缩、膨胀等形变。同样，不同植物的叶片结构、组成等特征具有差异，没有一种SEM 处理和观察方法能够适用于所有类型的植物叶片。高含水量的样品经过脱水干燥处理后，要想获得在电镜下清晰、细胞形态饱满且没有皱缩塌陷的图像，目前来说还只是一个理想的状态。未来能否有一种既简单方便又能达到更好效果的方法，还需要大家继续探索。