脂肪干细胞来源外泌体在皮肤创面修复中的作用机制

姜文彬 陈雳风 孙家明

【提要】 皮肤创面修复有多种方法，但均存在一定的局限性。近年来，有关脂肪干细胞来源外泌体的研究日益增多，大量研究表明脂肪干细胞来源外泌体在皮肤创面修复过程中具有积极的作用。本文对脂肪干细胞来源外泌体在皮肤创面修复中的作用机制研究进行综述，并展望其在皮肤组织再生领域的应用前景。

皮肤创面愈合，尤其是皮肤慢性伤口愈合是所有皮肤疾病中医疗费用最高的一类，仅在美国，每年就有281 亿美元以上的医疗支出用于治疗慢性创面［1］。尽管皮肤组织具有一定的自我修复能力［2］，但创面愈合不良，尤其是暴露部位的创面愈合不良，仍可导致皮肤屏障功能减弱、组织感染和坏死等严重后果。临床上迫切需要更新、更有效的方法来促进愈合过程，以达到形态和功能上的最佳效果。外泌体是指由干细胞分泌的具有单层膜结构的微小囊泡，直径30～200 nm。根据目前的研究，外泌体具有与细胞相同的拓扑结构，其中包含了复杂的RNA、脂质和蛋白质。研究发现，外泌体除了可以在免疫学、肿瘤生物学和神经生物学中作为生物标志物［3］、生物载体［4］和治疗工具［5］外，在组织再生方面也具有潜在的临床应用价值。脂肪干细胞具有来源广泛、取材方便等优点，该来源的外泌体在多种组织的修复和再生方面具有治疗潜力［6］，其中也促进皮肤组织创面的愈合［7］。

1 脂肪干细胞外泌体

脂肪干细胞（Adipose－ derived stem cells，ADSCs）在人体内储量丰富，应用脂肪抽吸术可以很容易地从皮下脂肪组织中获得ADSCs［8］。ADSCs具有强大的增殖分化能力、多向分化能力，且获取便利、创伤小、副作用少，常用于组织再生与修复，是组织工程领域的研究热点。越来越多的研究发现，ADSCs 发挥作用主要依赖于旁分泌机制，通过向胞外分泌大量物质来实现，如可溶性细胞因子、生长因子、功能蛋白、脂质、microRNAs、lncRNAs 等［9－11］。

外泌体（Exosomes，Exos）是包含了复杂RNA 和蛋白质的微小囊泡，直径为30～200 nm，主要来源于细胞内溶酶体，它是由溶酶体微粒向内凹陷形成多泡体，而后多泡体与细胞膜融合，将其内的微小囊泡分泌到胞外而形成。研究发现，Exos 可广泛参与细胞间的信息交流及多种生理、病理过程，如机体免疫应答、抗原呈递、细胞分化等。Exos 的免疫原性低于细胞，可有效降低由细胞移植导致的免疫排斥；而且，Exos 与干细胞不同，在使用上不存在伦理学问题，这使其可代替干细胞进入临床应用。根据目前的研究，ADSCs－Exos 在皮肤创面愈合［12］、骨与软骨再生［13］、受损神经修复及心肌损伤修复［14］、肾脏损伤修复［15］、肝脏损伤修复［16］等领域有广阔的应用前景。

1.1 ADSCs－Exos 的分离纯化

方便快捷的分离纯化法，是标准和高效地进行ADSCs－Exos 研究的保障。目前，分离纯化ADSCs－Exos 最常用的方法是差速离心法，利用外泌体与其他物质间直径大小以及密度的差异，通过一系列不同离心力、不同离心时长的超速离心［17］逐步将其他物质沉淀后去除，最终分离出外泌体。超速离心通常由多个步骤组成，首先低离心力（300 ×g，10 min）去除死亡细胞和凋亡碎片，然后提高离心力［（1 000～20 000）×g，20～30 min］去除较大的囊泡和碎片，最后以高离心力（100 000 ×g，70 min）获得ADSCs－Exos［18］。此方法操作简便，得到的外泌体量多，但是提取时间长，且提取的外泌体纯度不足［19］。

免疫磁珠法也是常用的ADSCs－Exos 分离方法。外泌体膜上存在着多种特异性蛋白，利用抗体与外泌体膜上的特异性蛋白产生免疫反应，经沉淀可分离外泌体。免疫磁珠吸附分离耗时短，外泌体纯度高，但分离前需进行充分的预处理，以去除其他的细胞外囊泡，否则将影响外泌体的纯度。

近年来，一些新方法被用于ADSCs－Exos 的分离和纯化，如微流控技术、尺寸排阻色谱技术、静水压滤透析技术以及超滤技术等。每种方法都有其优缺点，目前还没有统一的规范，应根据实验科学背景及后续实验内容选择合适的分离纯化方法［20］。

1.2 ADSCs－Exos 的鉴定与储存

脂肪干细胞来源外泌体鉴定的常用方法有形态学分析、特异性蛋白表达。电子显微镜下观察ADSCs－Exos，可见膜的茶托样结构，直径30～200 nm；利用Western blot 或抗体芯片对ADSCs－Exos 表面特定蛋白进行检测，其表面蛋白阳性表达的有FLOT1、ICAM、ALIX、CD81、CD63、ANXA5、TSG101 等。

外泌体通常储存于－80 ℃环境下。但最近的报道表明，与新鲜提取的外泌体相比，在－80 ℃条件下长期保存的外泌体并不稳定，有可能导致其内部RNA 的降解。Charoenviriyakul 等［21］开发了一种冻干储存外泌体的方法，在室温下储存冻干外泌体，既不会影响外泌体RNA 含量、理化和药代动力学特性，也不会影响外泌体上蛋白质和DNA 的功能。

2 皮肤组织的结构与皮肤创面愈合的过程

2.1 皮肤组织的结构

皮肤是在人体表面直接同外部环境接触的组织，具有保护、分泌、调节体温等重要作用。皮肤分3 层，最外层的表皮主要由复层扁平上皮组成，由浅到深又可细分为角质层、透明层、颗粒层、棘细胞层、基底层等5 层；中间的真皮层主要由胶原纤维、弹力纤维构成，内含丰富的血管、神经末梢、毛囊和各种腺体，由浅到深可细分为乳头层和网状层；最深处的皮下组织，位于真皮以下肌肉筋膜以上，是维持皮肤弹性的重要结构，主要成分为脂肪组织［22］。

2.2 皮肤创面愈合的过程

皮肤创伤是由于疾病或外部暴力而导致的表皮、黏膜或组织破损。皮肤具有自我修复能力，皮肤创面的愈合由一系列复杂而动态的组织恢复阶段组成，常需要免疫细胞、造血细胞和皮肤常驻细胞的共同参与［23］。深达真皮的皮肤创面修复包括4 个相互重叠的阶段，分别为止血、炎症、增殖和重塑，每个阶段又有精密调节的多个子阶段。各个阶段间相互依赖，密不可分。

第一阶段是止血阶段，这是机体对创伤的迅速反应。在这个阶段，血小板和纤维蛋白原的聚集会导致血凝块的形成，暂时封闭伤口［24］，有的凝块表面干燥形成痂皮，凝块及痂皮可起到保护伤口的作用。第二阶段是炎症阶段，皮肤创面形成后数小时内便出现炎症反应，表现为局部充血、浆液性渗出及白细胞游出，故导致创面局部红肿。早期白细胞浸润以嗜中性粒细胞为主，约3 d 后转为以巨噬细胞为主。血小板释放的细胞因子将中性粒细胞和巨噬细胞聚集到创伤部位，和常驻的肥大细胞一起，开始杀灭入侵的微生物，并清除创伤部位的细胞碎片［25］。第三阶段是增殖阶段，由白细胞释放的激素诱导内皮细胞和成纤维细胞向伤口中心迁移，形成新的血管和肉芽组织。肉芽组织由伤口底部及伤口边缘长出，以填平缺损组织，其中没有神经，故无感觉。毛细血管以0.1～0.6 mm／d 的速度增长，生长方向大都垂直于创面，并呈袢状弯曲。从伤后第5～6 天起，成纤维细胞产生胶原纤维，其后的1 周内胶原纤维形成更为活跃，以后生成速度逐渐减缓。随着胶原纤维的增多，瘢痕形成，可能是由于局部张力的作用，瘢痕中的胶原纤维最终与皮肤表面平行。同时，创面周围的成纤维细胞也可以进一步刺激伤口边缘角质形成细胞的迁移和增殖，使新表皮完全覆盖伤口。第四阶段是重塑阶段，为了恢复正常皮肤的结构，瘢痕重塑，新沉积的胶原分子交联，导致组织的拉伸强度增加［26］，在此过程中胶原纤维不断合成、交联和降解，这一阶段可长达数月至数年［27］。

3 ADSCs－Exos 促皮肤创面修复的机制

皮肤创面愈合是机体动态、精密的生理反应过程。内源性ADSCs 已被证明参与了皮肤创面的愈合过程，其分泌的Exos 也被证实在减轻炎症反应、加速血管生成、促进成纤维细胞的增殖与迁移和细胞外基质的重塑中发挥着不可替代的作用。

3.1 ADSCs－Exos 可通过多种机制减轻炎症反应

炎症反应是创面修复的始动环节之一，但过度的炎症反应会延缓皮肤创面的愈合过程，并可能使创面发展为经久不愈的慢性创面，故减轻伤口愈合的炎性反应是皮肤创面修复中的重要一环。炎症反应阶段是以血管系统为中心的一系列局部反应，由巨噬细胞、淋巴细胞、浆细胞等共同参与，炎性反应阶段可清除坏死组织及入侵细菌，促进愈合过程。研究发现，减少创面的炎症反应，可以减少瘢痕的生成。例如，早期胎儿和口腔伤口的无瘢痕愈合过程，是缺乏典型的炎症反应的创面愈合［28］，这类过程与伤口炎症反应下游的转化生长因子β1（TGF－β1）有关［29］。外泌体减轻炎症反应的机制多种多样，如介导siRNA 传递来阻断神经系统炎症小体激活［30］；通过抑制促炎酶和细胞因子的分泌而发挥抗炎作用［31］；通过LIN28b／LET－7 轴抑制核因子κB（NFκB）的激活，从而抑制牛子宫内膜上皮（BEND）细胞的炎症［32］；通过3 个特异性miRNAs（miR－21、miR－146a 和miR－181），抑制小鼠内毒素诱导的炎症［33］。其中，ADSCs－Exos 对减轻炎症反应的作用更为突出［34］。首先，ADSCs－Exos 可诱导巨噬细胞向M2 表型极化，从而降低了巨噬细胞激发炎症反应的能力［35］；而白细胞介素－10（IL－10）作为一种有效的抗炎物质，能够抑制由炎症反应造成的创面延迟愈合。另外，高表达Nrf2 的ADSCs－Exos 可降低IL－1β、IL－6 和TNF－α 等炎症细胞因子水平，从而降低创面的炎症反应［36］。

3.2 ADSCs－Exos 可加速血管生成

局部血液循坏是影响创面愈合的重要因素，可以提供组织再生所需营养物质和氧气，促使细胞生长、肉芽组织形成；另外，对吸收坏死组织及控制局部感染也起到了重要作用［37］。当局部血流循环良好时，创面再生修复快；相反，局部血液供应不良时，该处的创面愈合迟缓。新生血管的形成是加速局部血液循环的关键，在创面愈合的过程中意义重大［38］。研究发现，ADSCs－Exos 可以刺激内皮细胞增殖、迁移和血管形成，进而增加局部组织的血液循环，加速创面愈合过程。这种加速血管生成的效应多是通过各类特异性miRNAs 的高表达来实现的。实验证实，通过miR－130a 的高表达，可显著促进小鼠体内的血管生成［39］；通过miR－21 的高表达，可明显促进人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的血管化［40］。另有研究发现，ADSCs－Exos 可以通过转运功能性酶，如基质金属蛋白酶（MMPs），来增加内皮细胞的迁移和血管的形成，加速血管生成的过程［41］。

3.3 ADSCs－Exos 可促进成纤维细胞的增殖与迁移

促进成纤维细胞的增殖、迁移是皮肤创面愈合以及伤口收缩的关键。纤维蛋白凝块的分解、细胞外基质（ECM）的重塑和胶原纤维的形成过程，都有成纤维细胞的参与［42］。ADSCs－Exos 可以通过多种机制促进成纤维细胞的增殖与迁移。多项研究表明，外泌体miRNA 对成纤维细胞有积极作用。如，人羊膜上皮细胞来源的外泌体miRNA 可促进成纤维细胞增殖和迁移，促进伤口愈合［43］；外泌体miRNA 的上调会促进癌症相关成纤维细胞（CAF）的形成和激活［44］。另外，Exos 内包含的各类蛋白也对成纤维细胞有着重要影响。Bakhtya 等［45］证明了Exos 在体外可以提高成纤维细胞活力，并在小鼠的穿孔活组织创伤模型中促进皮肤伤口的愈合，这些效应与Exos 内含有大量的α2 巨球蛋白有关。而ADSCs－Exos 作用于成纤维细胞增殖与迁移的研究，近些年开展广泛。研究认为，ADSCs－Exos 在角膜基质成纤维细胞的形成中可发挥关键作用，ADSCs－Exos 可以增强角膜基质成纤维细胞的活力，促进角膜基质细胞向成纤维细胞转化［46］。另外，ADSCs－Exos 可以通过优化成纤维细胞的特性来促进皮肤伤口的愈合。ADSCs－Exos 刺激成纤维细胞后，以剂量依赖的方式刺激细胞迁移、增殖和胶原合成［47］，Ⅰ型胶原（COL1）、Ⅲ型胶原（COL3）、MMP1、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和TGF－β1 mRNA 水平均升高，在体内可显著促进创面愈合［48］，在体外可提高p－Akt／Akt 水平，这是促进伤口愈合的重要信号通路［49］。Ren 等［50］的研究也证明了这一观点，认为ADSCs－Exos 加速了成纤维细胞中AKT 和ERK 信号通路的激活，在体外和体内均可促进成纤维细胞的增殖、迁移。

3.4 ADSCs－Exos 可促进细胞外基质的重塑

ECM 是细胞周围由多种大分子组成的复杂网络，与伤口愈合的重塑阶段密切相关，在瘢痕的形成过程中也发挥重要作用。但是，目前针对ADSCs－Exos 作用于皮肤创面处细胞外基质重塑的文献十分有限，大量研究仅停留在ADSCs－Exos 对细胞外基质的重塑的促进作用［51］，对于ADSCs－Exos 促进细胞外基质重塑的具体机制，仍有待进一步研究。

4 结论与展望

相较于细胞治疗，ADSCs－Exos 治疗具有来源丰富、易储存、性质稳定、免疫原性低、不受伦理限制等诸多优势，为今后的临床治疗方案提供了新的思路。因此，近些年相关研究广泛开展，针对ADSCs－Exos的制备与纯化、组成成分，及其促进组织修复机制的高质量研究越来越多，这为ADSCs－Exos 的临床应用提供了更加坚实的理论基础。此外，众多研究也提出了诸多不同的ADSCs－ Exos 应用方法，如直接注射ADSCs－ Exos 悬液、同敷料联合使用、结合载药技术等。近年来，3D 打印技术飞速发展，结合水凝胶光固化打印的ADSCs－Exos 水凝胶表面敷料将是未来的研究与应用的热点之一。

尽管有着诸多明显的优势，ADSCs－ Exos 的临床应用仍存在诸多问题。目前，外泌体的提取和纯化过程比较繁琐，且缺乏特定细胞来源外泌体的统一鉴定方法，应用于人体的安全剂量也尚未知晓，对其不良作用、副作用及长期效果还缺少深入研究［52］。

综上所述，ADSCs－Exos 为创面修复提供了一种新的可能，但要真正地应用于临床，必须先明确其发挥作用的具体机制、可能存在的不良作用、长期效果的稳定性、给药剂量及给药途径等，这一切都需要进行更为深入的基础研究和临床前期研究。