深低温保存同种异体肌腱的基础研究进展

张佩，王成，杨军

(遵义医科大学第五附属(珠海)医院手外科，广东 珠海 519100)

肌腱是骨骼与肌肉之间力量传递的重要组织，常应对较大的力量负荷，在活动过程中易造成急性损伤，因此在临床工作中肌腱损伤十分常见。肌腱移植在外科重建和修复治疗中的应用十分广泛，肌腱移植材料需求量也日益增加。目前的肌腱移植材料主要包括自体肌腱、异体肌腱、人工肌腱和组织工程肌腱等，其中同种异体肌腱因来源丰富、供区并发症少等优点在临床及科研工作中应用广泛[1]。移植成功率的提高取决于细胞活性、生物力学及免疫原性等方面。深低温保存是同种异体肌腱常见的处理方法之一，低温下能够对细胞进行加工储存，保证细胞和组织机构及功能的完整性。但低温冷冻在一定程度上会破坏细胞，严重的细胞应激还可导致不可逆的损伤，通过添加保护剂可以实现有效的缓冲，降低溶液的冰点，避免细胞暴露于有害浓度下，而且保护剂还可穿透细胞膜保护细胞内部结构[2]。同时，在解冻和复温时，还需要考虑细胞浓度、冷冻保护剂的选择和浓度以及解冻速率等。在冷冻保存前和冷冻保存后均需评估细胞的活力和功能，以便进一步优化冷冻保存过程[3]。为实现最佳移植效果，需进一步提高对低温生物学的认识。现就深低温保存同种异体肌腱的基础研究进展予以综述。

1 深低温保存定义

深低温(深低温冰箱-70～-80 ℃,液氮-196 ℃)保存是保持肌腱固有特性的良好储存手段。低温可以抑制正常机体组织细胞代谢活动，使其不产生化学反应过程，理论上，在此温度下的所有生物活动均会停止，包括一些导致细胞死亡的生物化学活动，深低温保存肌腱可为临床提供具有细胞活性和弹性良好的供体，且深低温保存同种异体肌腱移植效果与自体肌腱差异较小[4]。

深低温保存包括普通程序降温和玻璃化。普通程序降温是逐步降温，而玻璃化保存法是一种采用高浓度冷冻保护剂和单步快速降温的技术，可使细胞内外同时玻璃化，减少细胞内外冰晶形成造成的渗透性损害。玻璃化是一个动态过程，需要具有较特定阈值更快的冷却、升温速率，但这取决于所使用的玻璃化溶液的组成和总浓度。深低温保存法不仅能够有效消除肌腱免疫原性，还能很大程度地保留细胞活性，同时维持力学性能。

2 冷冻保护剂

常规的冷却方案在低温保存过程中可形成冰晶并增加溶质浓度，溶质浓度升高引起的损害可以通过使用冷冻保护剂来减轻。冷冻保护剂可与细胞内水分结合，防止冷冻过程中细胞内外冰晶的形成，减轻快速结冰带来的不可逆性细胞损害，同时还可避免细胞脱水引起渗透性增高造成的破坏作用。Sass等[5]用常见的冷冻保护剂二甲基亚砜和甘油低温保存肌腱，并比较天然肌腱和低温保存肌腱的生存活力，结果发现，经低温保存和解冻处理后，肌腱成纤维细胞的增殖能力并未发生显著变化。Hochstrat等[6]研究发现，使用二甲基亚砜低温保存肌腱组织可保持细胞活力，而在0.9%氯化钠溶液中保存的肌腱则无残留的代谢活性，在冷冻过程中细胞及组织结构被完全破坏。李雯瑛[7]将外周血造血干细胞深低温保存于二甲基亚砜和羟乙基淀粉保护剂中，细胞存活率高，且回收后外周血造血干细胞在体内能够快速恢复活性。Isildar等[8]使用二甲基亚砜和10%1,2-丙二醇制备了两种不同的冷冻保护液用于保存脐带组织，结果发现，在冷冻保护剂中保存的脐带组织的形态学和免疫表型与新鲜脐带组织无显著差异，同时可分离相似的间充质干细胞，且从10% 1,2-丙二醇冷冻保护液中分离的细胞的增殖速率较新鲜组织分离的细胞低，但均可观察到成骨和成脂分化。由此可知，加入冷冻保护剂的深低温保存细胞的增殖分化能力良好，与新鲜组织细胞的增殖分化能力的差异较小。同时，冷冻保护剂种类、浓度及配比也会影响保存效果，实际应用中应根据组织及细胞的特性选择合适的冷冻保护剂。

3 深低温保存对同种异体肌腱细胞活力的影响

3.1肌腱细胞 传统观点认为，肌腱仅由肌腱细胞(即肌腱的固有细胞)组成，经深低温处理后，细胞受损并失去活性，仅发挥生长支架的作用；随后对自体肌腱愈合机制的深入研究发现，肌腱细胞主动参与内在性愈合过程[9]。由于肌腱细胞内细胞液含量少，深低温保存时冰晶形成少，因此对细胞器及细胞膜的损伤也较小。孙燕琨等[10]研究表明，与新鲜对照肌腱相比，经深低温保存的肌腱活细胞的数量有所减少，但形态相似，同时可分裂、增殖并合成胶原纤维。另有研究表明，冷冻解冻后的肌腱细胞数量与新鲜肌腱相近，同时细胞水肿、成纤维细胞增殖等过程也与新鲜肌腱相似[11-12]。杨宇升等[13]研究表明，同种异体肌腱经深低温保存后早期组织学愈合过程较自体肌腱延迟，但24周后愈合程度与新鲜肌腱基本相同。由此可知，经深低温保存后，肌腱细胞的活性和数量均受到一定损伤，但仍能生长、增殖并参与愈合过程。

3.2肌腱干细胞 肌腱由纤维胶原束平行排列组成，组织内血供少，组成的成纤维细胞为成体细胞，代谢较低且自我修复过程缓慢，增殖分化能力也十分有限。与成纤维细胞相比，肌腱干细胞具有独特的优势[14]。肌腱干细胞是一种新型细胞，已成功地从人类、小鼠和新西兰兔肌腱及韧带组织中分离出来[15-16]。Zhang和Wang[17]研究表明，与肌腱细胞相比，肌腱干细胞具有不同的特性，包括细胞标记表达、增殖和分化潜能以及细胞培养时的形态等方面的差异。体外的肌腱干细胞可分化为脂肪细胞、软骨细胞及骨细胞；体内的肌腱干细胞可分化形成肌腱、软骨及骨组织[18]。而肌腱细胞几乎不存在分化潜能。还有研究发现，与骨髓间充质干细胞相比，肌腱干细胞的增殖更快，可表达更多肌腱相关基因与蛋白，组织学也可较早观察到胶原纤维束的规则排列，同时具有更丰富的细胞外基质[19]。Ni等[20]研究表明，肌腱干细胞可表达更多的与肌腱分化相关的信使RNA，具有肌腱干细胞的纤维蛋白结构较无肌腱干细胞的结构修复更早进行。可见，肌腱干细胞具有强大的增殖分化能力，在促进肌腱的修复和愈合过程中起关键作用。

深低温处理会损伤肌腱干细胞，并对其功能产生一定影响。但Mitchell等[21]研究表明，深低温保存肌腱干细胞与新鲜肌腱的活力、数量、形态、早期凋亡率、体外迁移能力以及分化能力无显著差异，解冻后24 h的肌腱干细胞仍处于原代，而解冻72 h后的大部分肌腱干细胞处于第四代增殖。因此，肌腱干细胞在肌腱损伤修复过程中极其重要。肌腱干细胞具有与正常细胞相似的生长、增殖和代谢过程，能够定向分化为肌腱细胞，分泌胶原纤维，维持完整的肌腱结构，从而发挥正常的生理功能，进一步促进肌腱损伤的愈合[22]。

4 深低温保存对同种异体肌腱生物力学性能的影响

肌腱的主要功能是力量传递，因此肌腱移植术后的抗拉强度和韧性是决定手术成败的关键因素之一。目前暂未对深低温保存中肌腱的生物力学性能的损伤达成共识。有学者认为，深低温保存对肌腱生物力学性能无影响[12,23-24]。Lee和Elliott[25]研究表明，虽然冷冻可以改变肌腱的微观结构，但在肌束和纤维水平上，新鲜肌腱与冷冻肌腱的所有参数比较差异均无统计学意义，表明冷冻对肌腱力学无影响，不会引起相应的机械或结构变化。Chen等[26]认为，新鲜冷冻的伸肌腱是伸肌机制重建的可行选择，尽管同种异体肌腱的细胞活力偏低，但其生物力学性能显著恢复。Negrín等[27]在重建内侧髌韧带的生物力学研究中发现，同种异体肌腱移植承受的最大拉伸力、刚度和伸长率等足以使其在体内进行重建并发挥正常功能。然而，有部分研究认为深低温保存可导致肌腱的结构及生物力学性能发生显著变化。如Giannini等[28]将22例深低温处理的胫骨后肌腱与新鲜对照肌腱进行比较发现，经深低温处理肌腱的极限荷载、极限应力以及极限应变均较新鲜肌腱有所降低，对肌腱力学性能有一定影响。Lansdown等[29]研究发现，在冷冻保存过程中，冷冻温度、冷冻介质种类及浓度以及多次冻融循环，可以改变结构特性，并导致不同的生物力学结果。可见，深低温保存过程中多种因素会对力学性能产生影响。

4.1冷冻温度 与常温相比，低温可通过抑制代谢和显著延缓离体组织储存过程中降解的生理过程来稳定生物结构。Hohmann等[30]研究表明，无论冷冻或解冻的温度如何，冷冻后肌腱的机械性能均会发生一定变化，低温保存后，肌腱弹性增大。Oswald等[31]发现，经液氮处理肌腱的蠕变应变和初始破坏应变均显著提高，且最大应变显著降低。因此，在低温保存前对肌腱进行快速冷冻可降低肌腱的负荷能力。与极低冷冻温度下的低温保存类似，经液氮处理的肌腱损伤可能由迅速降温的冷冻过程引起。因此，在同种异体肌腱移植的灭菌过程中，由于可能对肌腱性能产生负面影响，故不应使用液氮处理。缓慢、温和的冻存过程可减少冰晶形成，而冷冻温度的影响可能与液体丢失、渗透性改变以及其他物理损伤相关。评估反复冷冻和解冻温度的研究显示，冷冻对肌腱性能无影响[32]。

4.2冷冻介质 在目前的冷冻保存方法中，0 ℃以下组织及器官结构不受控制的冰晶形成是唯一最关键的因素，严重限制了冷冻和解冻过程中的储存效果。低温保存通常置于磷酸盐缓冲液中，不添加任何低温保护剂[33]。Chen等[34]研究表明，等渗缓冲溶液保证了细胞处于流体状态时的活力。冷冻可导致冰晶形成，破坏肌腱细胞和细胞外基质，使生物力学性能发生改变，而通过使用基于玻璃化的无冰冷冻保存技术可以较好地解决冰晶形成的问题。Hochstrat等[6]研究表明，二甲基亚砜对肌腱细胞和细胞外基质具有积极作用，与磷酸盐缓冲液中储存的肌腱相比，二甲基亚砜储存可以增强肌腱的生物力学特征；二甲基亚砜在冷冻过程中保持了肌腱细胞的活力，电镜下，磷酸盐缓冲液冻存肌腱的胶原纤维形态更不规则，而二甲基亚砜冻存的肌腱则保留了胶原结构。肌腱组织中主要为Ⅰ型胶原，Ding等[35]证明，冻融使胶原蛋白溶液形成微孔结构，孔隙主要被水填充，在冻结过程中，微孔结构变得更小、更有规则，导致胶原结构发生变化，而使用二甲基亚砜作为保护剂可以减少胶原结构变化。加入冷冻保护剂可以减少低温带来的冰晶损伤，使低温保存肌腱的结构与新鲜肌腱更接近，以维持正常的生物力学性能。

4.3冻融循环 新鲜冷冻是同种异体移植最常用的保存方法，与单次冻融循环相比，重复经历多个周期冻融对人肌腱的生物力学性能有一定影响。多次冻融循环会改变肌腱结构特性，导致生物力学性能变化[29]。Suto等[36]研究表明，反复的冻融循环会降低骨和肌腱结构中骨细胞的存活率，但不会影响肌腱的机械性能。Hochstrat等[6]表明，新鲜肌腱与冷冻一次的肌腱具有相似的动态杨氏模量。应用两个以上的冻融循环可能加剧肌腱组织的损伤，显著降低其最大负荷[25]。黄洪杰等[37]研究证实，冻融周期应少于3次，反复冻存复温会加剧肌腱组织损伤，使其易发生断裂。Chen等[34]研究表明，反复冻融可改变新西兰兔跟腱的组织结构，使跟腱的最大负荷、最大负荷能量和最大应力等部分生物力学性能显著降低。Arnout等[38]研究表明，3个周期内的冻融循环对生物力学性能无影响。相比之下，多次冻融循环削弱了同种异体肌腱移植的生物力学性能，使移植物更容易疲劳，甚至断裂[37]。

深低温保存对肌腱生物力学的影响与多种因素有关，包括冷冻温度、冷冻介质、冻融循环以及冻存时间、个体差异等。深低温在维持细胞代谢的同时也会对力学性能造成负面影响。针对不同个体及不同部位的移植要求，在保证功能的前提下尽可能多地保留肌腱力学特性。

5 深低温保存对同种异体肌腱免疫原性的影响

虽然自体肌腱移植一般不会发生排斥反应，但自体肌腱来源非常有限，无法满足临床需求。由于同种异体肌腱较丰富且不会导致新的创伤，近年来已成为研究热点。如果不去除同种异体肌腱的免疫原性，移植后将发生严重的排斥反应，导致手术失败，严重者甚至危及生命。因此，降低宿主与移植物的免疫排斥反应是目前亟待解决的问题。

5.1免疫机制 肌腱主要由肌腱细胞、胶原纤维以及细胞外基质等组成，其中肌腱细胞为抗原性的主要来源。未经处理的异体肌腱移植后可出现大量淋巴细胞，引起毒性反应，导致受体内产生以细胞免疫为主的免疫排斥反应。产生细胞免疫排斥反应的主要途径有：①供体抗原呈递细胞被受体T淋巴细胞直接识别；②受体T淋巴细胞识别肌腱细胞膜上被加工处理后的组织相容性复合物[39]。深低温保存可改变肌腱细胞膜上的组织相容性抗原，从而降低异体肌腱的抗原性。有研究表明，CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞主要通过细胞免疫和体液免疫的联合作用参与机体免疫排斥反应[40]，因此临床可以通过CD4+T淋巴细胞与CD8+T淋巴细胞的比值间接描述免疫排斥反应的严重程度。

5.2免疫相关细胞及蛋白的表达 自体肌腱移植是肌腱损伤后功能恢复重建的重要治疗手段。自体肌腱移植术后并发症少，且无显著不良反应，但供体来源有限。而异体肌腱移植与组织或器官移植类似，受体会产生排斥反应。张红星等[41]采用玻璃化保存法冻存同种异体肌腱，并与空白对照组(未经处理的同种异体肌腱)进行比较发现，玻璃化冻存同种异体肌腱移植后CD4、CD8、CD4/CD8均显著减少，在一定程度上减弱了同种异体移植产生的免疫排斥反应，进一步提高了移植成功率。Chen等[42]证明，肌腱的化学萃取可以消除免疫原性，而且每次处理均可进一步降低免疫原性。宫妍婕等[43]使用液氮冻存心脏瓣膜发现，保护液对心肌组织结构及其蛋白成分均具有更好的保护作用，且反映移植后排斥反应程度的人类白细胞抗原复合体分子的表达水平最低，表明深低温保存、化学处理、添加保护剂等均在降低同种异体肌腱免疫原性中起到不同程度的协同作用，继而使同种异体肌腱免疫原性显著降低，但各种方法联合处理时存在多种变量，为进一步研究带来挑战。

5.3移植与随访 同种异体肌腱体外保存的目的是为临床移植提供良好的受体，改善肌腱功能，提高患者生活质量。体内移植与随访的结果可更加直观地判断疗效和预后。涂泽松等[44]的试验显示，与自体肌腱重建前交叉韧带相比，同种异体肌腱移植的临床效果相似，但免疫排斥反应率低且安全，临床可根据病情及患者意愿灵活选择。另有研究指出，自体肌腱移植效果优于深低温保存的同种异体肌腱移植，如Fawzi-Grancher等[45]研究表明，与新鲜肌腱相比，冻干处理的骨骼和肌腱未见显著的细胞毒性；与植入后2周的新鲜冷冻肌腱相比，冻干处理的辐照肌腱的CD3、CD68浸润显著减少；且在新鲜冷冻/冻干辐照处理两个肌腱组织中均未观察到巨噬细胞浸润的显著差异。由此认为，冷冻干燥联合辐照等其他物理化学方法可能对降低免疫原性起到叠加作用。邓亚开等[46]对自体-异体混编肌腱与深低温保存同种异体肌腱重建兔前交叉韧带进行比较发现，自体-异体混编肌腱组CD31免疫组织化学染色血管计数及苏木精-伊红染色细胞计数在术后3、8、12周均高于深低温保存同种异体肌腱组，达到一定峰值后，自体-异体混编肌腱组与深低温保存同种异体肌腱组的差异逐渐减小。深低温保存同种异体肌腱免疫排斥反应虽较自体肌腱多见，但在较长时间的术后随访中趋于稳定并愈合良好。

6 小 结

深低温保存同种异体肌腱能够维持细胞和组织活性以及良好的生物力学性能，且可有效去除免疫原性，减少排斥反应的发生，是目前临床和科研工作中最常用的保存方法。但深低温保存同种异体肌腱还应考虑成本、时间、机械强度变化以及疾病传播的风险，可根据患者的年龄、活动水平、活动类型、并发症以及患者的需求等多种因素制订不同的保存方案[47]。深低温保存过程中相关的因素众多，与降温速度、冷冻保护剂的配比及浓度等均有较大关系。同时，冷冻保护剂存在细胞毒性，如何控制其毒性达到最佳保护效果，临床需进一步研究探索。未来仍应支持深低温保存在同种异体肌腱移植中的应用，以提高成功率。