环状RNA在肝细胞癌中的研究进展

胡心瑶，朱华，徐细明

(武汉大学人民医院a.肿瘤科，b.神经外科，武汉 430060)

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是原发性肝癌的主要表现形式，占肝癌患者总数的75%～85%[1]，也是全球恶性肿瘤相关死亡的第二大原因[2]。HCC目前常用筛查手段为影像学检查和血清甲胎蛋白检测[3]，但其敏感性仍不足。在一项针对HCC患病率为5%的人群研究中，甲胎蛋白对HCC的阳性诊断率仅为25%[4]。HCC起病隐匿，易发生早期转移，多数患者临床诊断时已为晚期[5]。尽管手术切除、肝移植、射频消融等治疗技术不断进步，但HCC晚期患者的5年生存率仍低于20%[6]，因此迫切需要探寻新的早期诊断手段和有效治疗方法。

环状RNA(circular RNA，circRNA)是一类单链闭环结构的非编码RNA[7]，曾被认为是RNA剪接过程中的中间产物或错误的副产品而被忽视[8]。近年研究证实，circRNA是广泛存在、表达丰富、稳定、保守的非随机产物[9]，circRNA成为近年的研究热点。除上述特点外，circRNA还在各种体液中表达，并在肿瘤中特异性表达，发挥促进或抑制肿瘤发生发展的作用，提示circRNA在肿瘤诊断、治疗和预后等方面有重要意义，有望成为HCC新的诊断标志物和治疗靶点。现对circRNA的特点、功能及其在HCC诊治过程中的作用予以综述，旨在为HCC的诊断和治疗提供新思路。

1 circRNA的生成和主要特点

RNA的选择性剪接是真核细胞的基本基因表达方式。信使RNA(messenger RNA，mRNA)前体在剪接体的催化作用下除去内含子，剩下的具有蛋白质编码信息的外显子顺次连接组成成熟的mRNA[10]。与mRNA的典型剪接不同，circRNA通过反向剪接产生，将下游的5′剪接供体与上游的3′剪接受体连接形成单链共价闭环[11]，随后剪接体去除全部或部分内含子产生3种circRNA，包括仅包含外显子序列的外显子circRNA、仅包含内含子序列的内含子circRNA以及同时包含外显子和内含子序列的外显子-内含子circRNA[12]。

目前被广泛认可的circRNA生物发生的驱动机制包括套索驱动的环化模式以及内含子配对驱动的环化模式[13]。在套索驱动的环化模式中，mRNA前体中的远端外显子彼此靠近，随后上游外显子3′端的剪接供体与下游外显子5′端的剪接受体共价结合后再切除内含子而构成外显子circRNA。当位于套索中的内含子没有被完全剪接移除时，它们就留在环绕的外显子中，形成外显子-内含子circRNA。内含子配对驱动的环化模式主要由两个内含子通过Alu重复序列碱基互补配对后自身环化，继而切去内含子，构成circRNA。

circRNA的封闭环形结构特点使其具有独特的生物特性：①稳定性，circRNA为单链共价环状结构，不包含5′端帽子和3′端尾巴，不能被外显子酶降解；②进化保守性，人类与小鼠的circRNA同源性达20%以上[14]，并与果蝇有同源性；③多样性，circRNA可以在大多数生物体中检测到，且同一基因可以产生不同的circRNA，进一步增加了circRNA的丰度；④特异性，在不同组织、生长阶段、病理过程中，circRNA的表达水平均不同。上述特性是HCC成为灵敏、准确的生物学标志物以及有效治疗靶标的基础[15]。

2 circRNA的生物学功能

circRNA中，以外显子circRNA最常见，其主要存在于细胞质，而内含子circRNA和外显子-内含子circRNA在细胞核中含量较丰富[16]。circRNA通过多种作用途径在多种疾病，尤其是恶性肿瘤的形成、发展中起重要作用，参与肿瘤细胞的增殖、转移、侵袭及凋亡。

2.1作为微RNA(microRNA，miRNA/miR)海绵 circRNA作为一种竞争性内源RNA，可携带多个miRNA反应元件，作为海绵吸附miRNA，降低其表达，通过影响miRNA下游通路发挥多种生物学作用，参与恶性肿瘤的发生发展[17]，这是circRNA最核心的作用。小脑变性相关蛋白1反义转录物是首个被证实作为miRNA海绵发挥作用的circRNA，它具有70个以上的miR-7结合位点，可以大幅度降低miR-7的表达[18]。但近年研究发现，仍有许多circRNA几乎没有与miRNA的结合位点，且高通量测序分析显示，miRNA海绵效应机制不能应用于所有circRNA[19]。

2.2与RNA结合蛋白(RNA binding protein，RBP)相互作用 circRNA与RBP之间存在动态、多样的相互作用。circRNA可以在RBP的辅助下间接调节基因转录。例如，argonaute是一类沉默miRNA的RBP，circRNA可以协助argonaute蛋白与miRNA相互作用，从而降低miRNA与相应mRNA结合的能力。circRNA还可与mRNA竞争结合RBP，影响mRNA翻译。此外，circRNA还可作为RBP的超级海绵，影响RBP的表达，同时调节靶基因的翻译[20]。

2.3选择性剪接和亲本基因转录的调控 circRNA的反向剪切可以与mRNA前体竞争剪切位点，抑制mRNA的表达。此外，在反向剪切的过程中，circRNA可能封闭翻译起始位点，阻止mRNA转录，从而降低某些蛋白质的表达[21]。调节亲本基因转录的circRNA大多存在于细胞核，主要是内含子circRNA和外显子-内含子circRNA[18]。它们与U1小核糖核蛋白形成复合物，进一步与亲本基因启动子相互作用，增强基因的转录和表达[21]。

2.4翻译蛋白并作为蛋白质支架 少数circRNA还可以编码蛋白质。circRNA SHPRH(SNF2 histone linker PHD RING helicase)可通过编码分子量为17 000的SHPRH-146aa来保护与其相关的全长SHPRH蛋白，从而发挥肿瘤抑制因子的作用[22]。circRNA还可以作为支架促进两个或更多蛋白质之间的接触和作用。circRNA FoxO3具有鼠双微粒体-2基因和p53的结合位点。这些结合位点的突变或circRNA的敲低均会导致鼠双微粒体-2基因抗体对p53的抑制减少[23]。

3 circRNA在HCC发展中的作用

有研究在HCC组织和相应正常肝组织中的分析报告中发现了1 245个差异表达的circRNA，其中756个表达上调，489个表达下调[24]，提示circRNA在HCC发生发展中可能有重要作用，寻找起关键调控作用的circRNA并加以干预可能为HCC的诊断和治疗提供新思路。

3.1circRNA抑制HCC增殖和转移 circRNA MTO1(hsa_circ_0007874/hsa_circ_104135)在HCC组织中表达显著下调，且低表达circRNA MTO1患者的生存期明显缩短；进一步研究发现，circRNA MTOR作为miR-9的海绵下调miR-9，进而促进miR-9的靶标p21的表达[25]。p21是一种细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，起抑制细胞周期、抗增殖的作用，其高表达阻碍了HCC的进展[26]。此外，在HCC中下调的还有hsa_circ_0001649[27]，它作为miR-127-5p、miR-612和miR-4688的海绵，通过激活下游SHPRH的表达抑制HCC的进展[28]。敲除hsa_circ_0001649可大大增加与HCC侵袭和迁移高度相关的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)的表达，如MMP-9、MMP-10和MMP-13。生物信息学分析表明，hsa_circ_0001649还具有多种RBP的潜在结合位点，包括U2AF65、EIF4A3和UPF1[29]，表明其可能作为蛋白质海绵或转录调节因子来调控HCC的进展。

hsa_circ_0005986在HCC组织和细胞中表达下调，它作为miR-129-5p的海绵减少其表达，进而导致其靶基因Notch1过表达来抑制HCC的进展和转移[30]。此外，敲除HCC细胞中hsa_circ_0005986会加速细胞从G0/G1期到S期的转变，导致癌细胞增殖。而过表达hsa_circ_0005986则抑制HCC的增殖和迁移能力。circRNA SMAD2在HCC组织中的水平也显著低于邻近非肿瘤组织，影响了HCC组织的分化程度。上调circRNA SMAD2可阻碍HCC细胞的迁移、侵袭和上皮-间充质转化，而miR-629是circRNA SMAD2的靶点[31]。circRNA C3P1是另一个在HCC中表达下调的基因，其表达水平与HCC的TNM分期、肿瘤大小、血管侵袭程度呈负相关[32]。circRNA C3P1通过对miR-4641的海绵效应增强PCK1的表达，而PCK1是糖异生的关键调控点，最终发挥抑制肿瘤的作用。因此，外源性增强关键抑癌circRNA的表达有望为HCC的治疗提供新思路。

3.2circRNA促进HCC增殖和转移 促进HCC发展的基因往往在肝癌组织中高表达，且其高表达往往提示HCC分期高、患者预后差、治疗难度大等。小脑变性相关蛋白1反义转录物是研究较广泛的circRNA，通常发挥促癌作用，其经典作用机制是作为肿瘤抑制因子miR-7的海绵，抑制miR-7下游的多种抗肿瘤蛋白，包括磷酸肌醇-3-激酶催化的delta多肽、核糖体S6蛋白激酶、S6激酶1、细胞周期蛋白E、表皮生长因子受体等，从而促进HCC细胞的增殖和侵袭。Twist是一种关键的上皮-间充质转化诱导转录因子，它通过上调circRNA-10720隔离一系列直接靶向波形蛋白的miRNA，进而增加上皮-间充质转化中波形蛋白的表达，诱使HCC细胞发生上皮-间充质转化，使其获得侵袭性并向远处转移；沉默的circRNA-10720在体内和体外都抑制了Twist1的促瘤效果，这为HCC提供了潜在的治疗靶标[33]。hsa_circ_0039053也是一个表达上调的致癌基因，它通过与miR-637相互作用正向调控USP21的表达，USP21通过去泛素化稳定促分裂原活化的蛋白激酶激酶2，促进肿瘤生长[34]。

近年来，越来越多的致癌circRNA被发现，如has_circ_001306通过miR-584-5p/周期蛋白依赖激酶16轴促进HCC的进展[35]，hsa_circ_102559作为miR-130a-5p的海绵增加其靶基因膜联蛋白A2的表达，从而促进HCC的进展[36]。circRNA HIPK3可作为多种miRNA(如miR-124、miR-558、miR-193a和miR-379)的海绵发挥作用，可通过降低miR-124的表达上调水通道蛋白3，从而促进HCC细胞的增殖和迁移[37-38]。沉默circRNA HIPK3可能是一个新的治疗手段。此外，下调circ_0067934表达可显著阻碍HCC细胞的增殖、转移和侵袭，并诱导其凋亡[39]。circ_0067934可以激活卷曲类受体5/Wnt/β联蛋白信号通路促进HCC进展[40]，表明circ_0067934/miR-1324/卷曲类受体5/β联蛋白信号轴可能是具有研究潜力的信号通路。此外，在HCC组织中circRNA RBM23高表达可增加HCC细胞的活力，并促进其迁移，而沉默circRNA RBM23可促进miR-138转录，下调靶基因细胞分裂素D3和波形蛋白的表达，进而阻碍HCC细胞的增殖和迁移[41]。通过关键致癌circRNA的小干扰RNA或短发夹RNA来敲除或下调相应circRNA的表达是HCC治疗的新方向。

3.3circRNA调控肝炎病毒感染引起的HCC 在HCC高发地区，慢性乙型肝炎病毒感染导致的HCC占全球原发性肝肿瘤的50%以上[40]。已有研究发现，circRNA/miRNA调控轴可能参与乙型肝炎病毒感染的有关途径[42]。此外，miR-122同时起HCC抑制剂和丙型肝炎病毒复制增强剂的作用[16]，可通过设计circRNA海绵吸收miR-122[41]，从而阻碍丙型肝炎病毒的复制。但这种海绵效应会同时诱导肝癌发展，因此亟需进一步寻找精准针对肝炎病毒复制的miRNA，以设计出无不良反应的circRNA海绵用于临床治疗。还有研究发现，circRNA-100338的升高通过circRNA-100338/miR-141-3p/在大脑中富集的Ras同源物轴激活HCC的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路，从而影响肝炎相关HCC的预后[43]。另有报道，circRNA还可参与调节抗病毒免疫应答，circRNA对宿主免疫系统的影响可能是其调节肝炎病毒感染引起HCC的另一种机制[44]。然而，目前的研究尚未充分了解乙型肝炎病毒/丙型肝炎病毒感染与circRNA的关系，需要更多的研究模型来探索circRNA在肝炎病毒相关性HCC发病机制中的作用，从而加以干扰和治疗。

3.4circRNA影响HCC微环境巨噬细胞浸润 有研究从TCGA(The Cancer Genome Atlas)数据库中HCC患者的癌和癌旁组织中筛选出837个(上升566个，下降271个)与巨噬细胞相关的差异表达mRNA，在GSE14520的214例HCC患者的癌及邻近非癌组织中发现了705个(上升275个，下降430个)与巨噬细胞相关的mRNA[1]。叠加分析得到274个(116个上升，158个下降)巨噬细胞相关的差异表达mRNA，这些基因可能在免疫相关过程中(如急性炎症反应、补体的初始触发、对肿瘤坏死因子的反应、正向趋化、适应性免疫反应的正向调节和防御反应的负向调节)被富集。已经明确了6个差异表达的mRNA(Zeste同源增强子2、依赖于细胞周期调控因子10抗体的转录物2、多聚酶抑制复合物1、驱动蛋白超家族蛋白4A、整合素α6和层粘连蛋白C1)用于构建circRNA调控网络，包括9个circRNA-miRNA-mRNA轴，表明circRNA可能通过circRNA-miRNA-mRNA轴影响mRNA的表达，最终影响HCC微环境中巨噬细胞浸润，参与HCC的发生发展[1]。未来仍需要更多研究来发掘circRNA完善HCC微环境巨噬细胞浸润相关的circRNA调控网络，通过增加或抑制关键circRNA的表达促进机体对肿瘤细胞的免疫清除。

4 circRNA在HCC诊断和预后中的应用

4.1circRNA与HCC的诊断 circRNA诊断HCC的灵敏度为0.75(95%CI0.73～0.78)，特异度为0.78(95%CI0.75～0.81)，曲线下面积为0.86[45]，提示circRNA是HCC的潜在生物诊断标志物[46]。小脑变性相关蛋白1反义转录物主要存在于细胞质，通常随疾病的发生释放入血，有望成为HCC诊断的早期生物标志物[47]。存在于HCC患者外周血单核细胞内的circ_0000798以及has_circ_0078602均已被证实有作为HCC患者无创诊断标志物的潜能[48]。HCC中has_circ_0003998存在差异表达，且HCC、乙型肝炎病毒感染患者与健康对照者的血浆has_circ_0003998水平比较差异有统计学意义[46]。has_circ_00156、has_circ_000224和has_circ_000520是新发现的高灵敏度、高特异度的生物标志物，可协助HCC的诊断[49]。

此外，circRNA有望作为HCC筛查和预后的生物标志物，部分circRNA同时具备海绵作用和诊断能力，如has_circ_u100338、circRNA FBLIM1在HCC细胞中不仅作为miRNA海绵促进肝癌细胞迁移[24,50]，还可作为HCC的诊断性生物标志物和治疗靶点。circ_104075在HCC组织、细胞系和血清中高表达，吸收miR-582-3p上调YAP促进HCC的发展。同时，circ_104075作为HCC诊断标志物的受试者工作特征曲线下面积为0.973，灵敏度为96.0%，特异度为98.3%，表明circ_104075具有诊断HCC的潜力[51]。circRNA-100338可以通过circRNA-100338/miR-141-3p/在大脑中富集的Ras同源物轴调控哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路，且circRNA-100338、在大脑中富集的Ras同源物、翻译启动因子5是乙型肝炎相关HCC预后不良的指标[43]。此外，circRNA ITCH过吸收miR-7、miR-17和miR-214，增加ITCH的表达，阻碍Wnt/β联蛋白信号通路，抑制癌细胞增殖[52]。Hsa_circ_0005075的表达与HCC肿瘤大小相关，并且具有区分邻近非肿瘤组织与HCC组织的良好潜力[29]。Hsa_circ_0005075还与细胞黏附密切相关，其曲线下面积为0.94，灵敏度和特异度分别为0.833 和0.900[53]，证明可通过Hsa_circ_0005075预测HCC的转移。未来还需要进一步的基础研究和临床试验，发掘更敏感、更准确的HCC诊断标志物，并与传统标志物结合，以提高HCC早期检出率，改善患者生命质量。

4.2circRNA与HCC的预后 对HCC患者预后的准确判断有助于指导治疗方式的选择，从而延长HCC患者的总生存期和无复发生存期，但目前尚无经临床应用验证的HCC预后标志物。基于circRNA的高稳定性和高丰度，其具有成为HCC预后标志物的巨大潜力。

Kaplan-Meier生存分析显示，在14个预示HCC不良预后的高表达circRNA中，circ_0000267、circ_001569、circ_0008450、circ_101368、circ_0128298、circ_0000517、circRNA BIRC6、circRNA MAT2B是HCC患者预后的独立指标[54]。circ_0000267、circ_001569和circ_0008450的表达与患者肿瘤大小和TNM分期相关；circ_101368的表达影响肿瘤大小、TNM分期和远处转移；circ_0128298高表达预示着血管癌栓生成以及肿瘤的淋巴、器官转移；circRNA BIRC6的表达与TNM分期和血管侵袭相关；而circRNA MAT2B的表达主要影响肿瘤大小、血管侵袭性、肿瘤包裹性、TNM分期和Edmonson分期[24]。此外，在HCC中高表达的circ_0000517可以调节促分裂原活化的蛋白激酶和Ras通路以及肿瘤抑制因子p53、MYC基因和蛋白激酶B1的表达，从而影响HCC患者的预后和分期[55]。

一些circRNA的低表达也预示着HCC的预后不良，如circ_0001649、circRNA ZKSCAN1、circRNA LARP4。circ_0001649的低表达预示着肝癌肿瘤体积更大以及肿瘤栓塞的发生[54]；circRNA ZKSCAN1的低表达与肿瘤数量、肝硬化程度、血管侵犯以及肿瘤分级等密切相关，且其表达水平与上皮细胞黏附分子水平在临床HCC样本中呈负相关，提示它可以预测HCC患者恶性肿瘤转移和预后的情况[56]；而circRNA LARP4表达降低与肿瘤的体积增大、Edmondson分期和TNM分期有关[57]。除HCC组织外，血清、外泌体、血浆或外周血单核细胞中的一些circRNA也已被确定为潜在的非侵入性预后生物标志物。HCC组织及血清中circRNA ZEB1.33的高表达与肝癌患者TNM分期及较低的总生存率相关[24]。

5 小 结

circRNA是近年的研究热点，其更高的稳定性和丰度成为HCC具有前景的诊断、预后标志物。目前关于HCC发展、诊治过程中circRNA作用的研究尚处于初步阶段，仍存在许多问题。首先，大多数circRNA的基因组研究使用微阵列分析方法，缺乏足够的样本量；其次，如何从大量的候选circRNA中挑选发挥关键作用且具有临床价值的circRNA是一个巨大的工程。circRNA通过多种途径(如与miRNA或蛋白相互作用、被翻译成功能蛋白、调控RNA前体或亲本基因转录等方式)调控HCC的发生发展，筛选出发挥关键调控功能的circRNA，阐明其靶向分子和信号通路，将有助于发掘circRNA作为HCC治疗靶点的巨大临床价值。