种子引发技术及其提高抗旱性的机制

张康康， 侯丹平， 谭金松， 毕庆宇， 毕俊国， 刘国兰， 余新桥， 胡立勇， 罗利军

(1.上海市农业生物基因中心， 上海 201106； 2.华中农业大学， 武汉 430072 )

干旱是造成农作物减产的重要影响因子。目前，全国受到干旱影响的耕地面积为783.8万hm2，占全国总耕地面积的30%[1]。干旱对农作物的影响从种子萌发期开始，贯穿整个生长阶段。在萌发期，干旱致使种子萌发不同步、萌发率低，甚至完全抑制种子萌发[2]。在生长阶段，干旱引起植物细胞膨压降低，抑制植物幼苗正常生长[2]，使植株弱小低矮。在生长后期，干旱影响花粉的活性，严重时导致花粉失活，致使粮食减产甚至绝收。为了应对干旱胁迫对农业生产的不利影响，科学家们采用多种手段在植物抗旱机理、提高植物抗旱性等方面做了大量的研究，取得了重要的成果。这些手段包括传统的筛选育种、杂交育种和新兴的基因工程育种、分子标记辅助育种。在栽培领域，种子引发是栽培学家用来提高植物抗旱性的一项重要手段。许多研究表明，种子引发在促进植物生长，增强植物抗旱性等方面发挥着重要的作用。

种子引发的概念首次由Heydecker等[3]于1973年提出，是一项控制种子缓慢吸水和逐步回干的播前种子处理技术[4]，它采用天然或合成的化合物处理种子，通过控制种子缓慢吸收水分使其停留在吸涨的第二阶段，使种子进行预发芽的生理生化代谢和修复，促进细胞膜、细胞器、DNA的修复和酶的活化，使其处于准备发芽的代谢状态，同时防止胚根伸出[5]。种子引发能够提高种子出苗的整齐度[6]，提高种子发芽率[7]，增加幼苗的干重和苗高[8-9]，打破种子休眠特性[10]，提高未成熟种子和老化种子的活力[11-12]，诱导植物产生抵抗干旱胁迫的能力。Zheng等[13]采用三种引发处理，均有效缓解了干旱胁迫对水稻幼苗的损伤，增强了水稻抗旱能力。在植物响应干旱胁迫中，经过引发处理的种子能够做出更快更积极的响应，由引发处理的种子所长成的植株，能够形成更迅速更强健的多重防御机制[14]。种子引发技术简单安全，省时省力，便宜有效，更容易被农民所接受，是一项具有广泛应用前景的可用来增强植物抗旱性的技术。

本文就目前国内外种子引发技术的研究进展以及种子引发提高植物抗旱性的机制进行了综述，回顾了传统的种子引发技术，如水引发、固体基质引发、渗调引发等，还阐述了新型种子引发技术，即物理引发、纳米引发，概述了引发技术提高植物抗旱性的机制，以期为受干旱制约的农业生产提供应对参考。

1 种子引发技术

1.1 水引发

水引发是先将植物种子放入水中预浸，保持适当温度，持续引发一定的时间(引发持续的时间由种子萌发吸水的快慢决定)，然后再将种子放置在阴凉处自然风干至种子初始重量[14]。水引发是一种简单经济、安全可行、易操作的技术，该技术的本质就是通过渗透调节作用改善种子内部的生理生化代谢，提高种子活力。研究表明，水引发通过调控种子内部的生理生化活动，增强种子活力、缩短萌发时间、提高发芽率、促进种子胚根生长、提高出苗整齐度、增强早期幼苗的抗性，从而增加作物产量[15-16]。尽管如此，水引发存在一定的缺点，可能会引起种子吸湿不均和引发期间微生物繁殖在种子表面等[5]。

1.2 固体基质引发

固体基质引发是美国Kamterter公司发明的种子引发技术，于1989年第一次利用这项技术进行种子引发商品化生产[17]，该技术通过固体基质控制种子吸水量达到引发目的。在固体基质引发体系中，种子、固体基质和水是三个基本组分，干种子能从固相载体中吸水直到平衡。目前常用的固体基质有片状蛭石、页岩、多孔生粘土、软烟煤、聚丙酸钠胶、合成硅酸钙、砂等[18]。研究报道，砂引发能够提高谷子种子在干旱胁迫下的出苗率[19]。Pandita等[20]通过将固体基质引发剂与木霉菌结合，改善了秋葵种子的萌发特性，提高了胁迫条件下秋葵的出苗率和产量。

1.3 渗调引发

渗调引发技术是以溶质作为引发剂，将种子置于溶液浸湿的滤纸上或直接浸于溶液中，通过控制溶液的水势同时调节种子的吸水速度和吸水量，从而达到引发效果的种子处理技术。根据引发剂的不同，渗调引发可以分成两类：有机渗透物质、无机渗透物质。

1.3.1有机渗透物质

有机物质如聚乙二醇(PEG)、壳聚糖和甜菜碱等。PEG-6000是植物引发剂应用比较广泛的高分子物质，溶液无植物毒性，能够形成较低的水势，很好地控制水分进入细胞。PEG引发苜蓿种子减轻了干旱胁迫对早期幼苗生长的有害影响，提高苜蓿幼苗的抗旱能力[21]。壳聚糖是一种天然的高分子多糖，主要来源于海产品加工的废弃物。常青山等[22]研究指出，使用适宜浓度的壳聚糖溶液浸种，可以改善种子各项萌发指标，降低干旱胁迫对种子萌发的不利影响。甜菜碱是植物体内的一种渗透调节剂、酶的保护剂，参与细胞的渗透调节，保持代谢关键酶在渗透胁迫下的活性，维持细胞膜的完整性。在干旱胁迫条件下，采用甜菜碱溶液引发白三叶种子，明显促进种子的发芽势、发芽率，提高幼苗干物质的积累，增强幼苗的抗旱能力[23]。

1.3.2无机渗透物质

无机盐类物质有氯化钙、氯化钾等氯化盐，硒的盐溶液，磷酸盐，硝酸盐等。作为一种渗透质，无机盐溶于水后，能够改变溶液的水势，降低渗透势，调节种子吸收水分，同时其水解离子还可以进入胚部细胞，改变细胞内的微环境，对种子预发芽的代谢活动产生影响。Rehman等[24]研究发现，氯化钙引发能够改善大田直播条件下的水稻产量。在干湿交替水分管理下，氯化钙引发增加有效分蘖数、穗长，提高生物产量和籽粒产量。硒是人类和动物必需的基本微量元素之一，是谷胱甘肽过氧化物酶的组成部分，能够有效防止活性氧引起的氧化损伤。研究表明，适宜浓度的硒引发增加小麦种子的总糖和总游离氨基酸的含量，增强小麦幼苗的抗旱能力。硒引发没有改变正常条件下幼苗的生物量，但在干旱条件下随着硒含量的增加，幼苗的生物量也显著增加[25]。

1.4 激素引发

激素引发是将种子浸泡在一定浓度的激素水溶液中进行种子引发的方法。植物激素是植物自身产生的，能够以微小的剂量对植物生长发育起显著调节作用的有机物。目前，种子引发常用的植物激素可分为两类：传统植物激素，如赤霉素、脱落酸、生长素、细胞分裂素；新型植物激素，包括油菜素内酯、水杨酸、茉莉酸类物质以及多胺。

1.4.1传统植物激素

生长素是最早被发现的一类激素，具有促进细胞分裂，调节种子萌发和植物生长发育的作用[26]。产IAA内生菌发酵上清液浸种处理玉米种子提高了高度干旱胁迫下种子的萌发率，缓解了高度干旱胁迫对玉米种子的伤害[27]。赤霉素能够打破种子休眠，促进种子萌发，促进叶片生长、花和果实发育。李洋等[28]研究表明，赤霉素引发老化的玉米种子，显著提高发芽率和苗高，提高种子活力，促进幼苗生长，是一种比较理想的种子引发剂。与赤霉素相同，细胞分裂素也具有打破种子休眠，促进种子萌发的作用。常见人工合成的细胞分裂素主要有激动素(KT)和6-苄氨基嘌呤(6-BA)。张文会等[29]研究认为，在PEG胁迫下，适宜浓度的6-BA可提高水稻种子的发芽率，促进根、芽的生长，提高水稻的抗旱性。脱落酸是一类有倍半萜结构的植物内源激素，具有抑制种子萌发，促进衰老的作用。随着研究的不断深入，Fujita等[30]发现脱落酸广泛参与植物对非生物胁迫的响应，如干旱，低温和渗透胁迫，它是植物的抗逆诱导因子。有研究报道，与未引发处理相比，脱落酸引发提高逆境环境下种子的萌发率[31]。

1.4.2新型植物激素

新型植物激素在种子引发技术上也得到了广泛应用。油菜素内酯是一种甾醇类激素，可促进植物种子萌发，提高光合作用，增强植物对逆境胁迫的抵抗能力。经油菜素内酯浸种可提高干旱胁迫下玉米种子萌发指数、根长，提高幼苗叶片光合速率，减轻干旱对玉米造成的损害[32]。水杨酸能够促进种子萌发出苗，帮助植物抵抗各种非生物胁迫。杨若鹏等[33]采用不同浓度的水杨酸引发黄瓜种子，结果表明，水杨酸引发通过提高抗氧化酶活性，提高可溶性蛋白、可溶性糖、游离脯氨酸含量，降低MDA含量来维持细胞稳态，减轻干旱胁迫对黄瓜生长的抑制作用，且以浓度1.0 mmol·L-1的水杨酸引发效果最好。茉莉酸类物质是植物自身产生的脂类信号物质，包括茉莉酸，茉莉酸甲酯及其衍生物，主要参与调控种子萌发，光合特性等生理过程。在抗逆防御方面，茉莉酸类物质能够应答外界刺激，传导逆境信号，启动抗逆响应调控机制。杨艺等[34]研究发现，适宜浓度的茉莉酸和茉莉酸甲酯引发可缓解干旱胁迫对棉花种子的伤害，促进种子萌发，增强根系代谢，减轻幼苗氧化损伤，增强植物抗旱能力。多胺是一类具有生物活性的低分子脂肪族含氮碱，广受关注的有精胺、亚精胺及腐胺，它们的代谢变化与逆境条件下植物的生长发育密切相关。Farooq等[35]采用将精胺、亚精胺及腐胺浸种和叶面喷施相结合的方法处理水稻，结果发现，多胺处理提高了水稻的净光合作用、水分利用效率，增加了游离脯氨酸、花青素和可溶性酚类物质的产生，改善了细胞膜的功能。在抗氧化剂中，过氧化氢酶活性与H2O2和膜透性呈负相关，表明多胺处理减轻了细胞膜的氧化损伤。

1.5 生物引发

生物引发是一种提前浸种并同时接种有益微生物的种子处理技术，结合了生物制剂(微生物)和生理浸泡(种子水合)两个阶段。生物引发接种的微生物主要有假单胞菌属，肠杆菌属，木霉属和芽孢杆菌属。接种的微生物能够定殖在植物根际，维持植物较长时间的生理生长状态[36]，因此生物引发能够促进作物的成熟。用具有抗干旱特性的哈茨木霉对小麦种子进行引发可提高小麦的抗旱能力。干旱胁迫下，引发处理增强ROS清除能力，提高L-苯丙氨酸解氨酶活性和总酚含量，减少脯氨酸，丙二醛和过氧化氢含量[37]。根际细菌常被用作接种剂来提高作物产量和抵御逆境胁迫。某些根际细菌能刺激植物生长，因此被称为促进植物生长根际细菌(PGPR)[38]。Kasim等[39]使用PGPR引发小麦种子，改善了植物体内的动态平衡机制，缓解了干旱胁迫对小麦的损伤。

1.6 物理引发

物理引发是通过采用物理介质处理种子的新型种子引发技术，采用的物理介质主要有磁场、γ-射线、超声波、紫外线、x-射线、微波等[40-41]。物理引发不仅成本低，清洁环保，低剂量的使用对种子无毒害作用，而且能够有效增强种子的抗逆能力。在物理引发中，磁场引发是唯一非侵入性的种子引发技术。磁场引发可以提高种子的发芽率、活力和幼苗的生物量，增强植物对生物和非生物胁迫的耐受性，这是因为磁场引发减少活性氧的产生，增强抗氧化酶的活性的原因[41-42]。干旱胁迫下，磁场处理通过清除自由基，降低细胞渗透势，减轻黄瓜幼苗体内膜脂过氧化水平，提高幼苗抗旱能力[43]。伽马射线(γ-射线)在农业科学领域是一种强大的诱变工具，它可以直接与细胞组分相互作用。伽马射线的生物效应主要取决于射线强度、剂量和暴露时间。伽马射线引发改善植物细胞的激素信号网络，激活抗氧化能力，最终提前打破种子休眠，提高发芽率，克服生长环境中的不利因素[44]。超声波引发是指使用频率20～100 kHz之间的机械波对种子进行引发处理。在现有的种子处理方法中，超声波引发是独一无二的，因为其具有快速、节能、环保等优势[45]。近年来，超声波因其可以打破种子休眠、改善种子萌发特性而得到了广泛应用。有研究报道，超声波引发会在种皮上施加机械压力，增加种子的孔隙度，即所谓的声空化，种子吸水率增强使得酶和其他生化反应得到激活。因此，超声波引发增强吸收的水的传质，使其能够与种子胚自由反应。由于水解酶的活性增加，赤霉素被释放导致糊粉细胞代谢速率增强，胚乳中的营养物质最终因细胞膜破裂得到动员[46]。

1.7 纳米引发

纳米引发是一项采用纳米材料引发种子的新型技术，该技术利用粒子尺度小于100 nm的纳米材料来改善种子生产、加工与处理，促进种子萌发，提高种子质量，具有广阔的发展前景[47]。纳米材料是指在三维空间中至少有一维处于纳米尺度范围 (1～100 nm) 或由它们作为基本单元构成的材料，常见的纳米材料类型包括碳基纳米材料(石墨烯、碳纳米管和富勒烯等)，金属基纳米材料(如纳米金属单质或者氧化)，复合材料等[48]。纳米材料具有特殊的性质，将纳米材料浸泡在水中，可以改变水分子的排列方式和能态，增加水的溶解力，提高水的细胞生物通透性[49]。利用纳米材料处理种子，可以增强种子的活力，提高种子体内各种酶的活性，进而促进植物根系生长，提高植物对水分和肥料的吸收，促进新陈代谢，在原有品种农艺性状的基础上进一步提高植物的抗病虫以及多重抗逆能力，达到增产和品质改善的效果[50]。大量研究表明，使用纳米材料引发可提高农作物种子的发芽率，促进幼苗干物质积累。如用微量营养元素的纳米粒子引发种子能够提高种子发芽率，促进幼苗发育[51]。在干旱胁迫条件下，纳米引发显著提高种子发芽率，增加根长、茎长，促进根、茎生物量的积累，有效减轻干旱胁迫对种子萌发和幼苗生长的伤害[52]。

1.8 其他引发物质

抗坏血酸是一种必不可少的维生素，也是非酶促反应活性分子，参与植物体内ROS的代谢过程，是自然界的抗氧化剂。抗坏血酸与其他抗氧化剂共同调节植物细胞内ROS平衡，减轻ROS对植物的伤害，从而维持细胞稳态，保证细胞正常生长，增强逆境胁迫下植物的抗逆能力，因此，抗坏血酸在植物响应环境胁迫中起着重要的作用。适宜浓度抗坏血酸溶液引发种子能维持植物的抗氧化能力，保护植物免受氧化胁迫损伤[53]。

褪黑素是一种多效性分子，最早被发现在牛的松果体中，被作为一种神经激素[54]。褪黑素可以促进根的再生，调节光周期作用，影响光合特性，提高植物的抗逆性。褪黑素对水分和脂类的亲和力较强，很容易穿透种皮和细胞膜，进入细胞内部，有效清除逆境胁迫对植物体产生的氧化损伤，增强植物抵抗逆境的能力。最新研究表明，褪黑素引发可以缓解干旱胁迫下油菜幼苗的氧化损伤，通过改善气孔数目、大小等特性，保持叶绿体结构完整性，维持细胞扩张，提高抗氧化酶活性及非酶促抗氧化剂的含量，最终提高油菜的抗旱性[55]。

丁烯酸内酯，最初英文命名为Butenolide。2009年，该物质被西澳大利亚大学最终命名为Karrikins[56-57]。研究认为，丁烯酸内酯能够促进拟南芥种子对光的响应，进而促进种子萌发。丁烯酸内酯也参与调控植物幼苗光形态建成，主要包括促进子叶生长、叶绿素积累以及影响下胚轴的生长等方面[58]。已有研究指出，丁烯酸内酯可以作为一种引发剂。使用丁烯酸内酯引发番茄种子，能够显著提高种子发芽率、发芽势、活力指数等，而且引发的种子能够保持较长时间的引发促进效应[59]。

2 种子引发提高植物抗旱性的机制

2.1 生理生化机制

2.1.1渗透调节

干旱胁迫下，植物细胞膜结构及功能受损，细胞溶质外流，渗透能力降低。渗透调节能够增加细胞质溶质的浓度，降低渗透势，维持细胞膨压，保持水分吸收和细胞各项生理功能的正常进行。干旱胁迫下，植物体内的渗透调节物质主要包括脯氨酸，可溶性糖，可溶性蛋白，甜菜碱等。最近的研究表明，种子引发积累更多的脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白等溶质，降低植物细胞的渗透势，维持幼苗生长，提高幼苗的抗旱性。而且，更高水平的可溶性糖能够为成苗及幼苗生长提供大量的能源物质[21]。类似的报道指出，种子引发提高脯氨酸、可溶性蛋白，稳定细胞的渗透调节能力，缓解干旱胁迫的不利影响[55]。淀粉代谢是种子萌发过程中重要的能量代谢，其代谢产生的可溶性糖可以维持细胞渗透调节的稳定。种子引发可以加速种子体内的淀粉代谢，主要原因是引发处理提高α-淀粉酶的活性，从而增加可溶性糖的含量，促进幼苗生长，增强抗旱性[13]。

2.1.2抗氧化系统

干旱逆境胁迫下，活性氧(ROS)将会过量积累，造成大量植物细胞的氧化损伤。抗氧化系统是胁迫条件下调控ROS积累的关键防御系统，故又称之为活性氧清除系统，由多种酶及非酶类物质组成的多因素调控网络，根据参与清除活性氧抗氧化剂性质的不同，将其分为非酶促抗氧化系统和酶促抗氧化系统。非酶促抗氧化系统主要包括抗坏血酸(ASA)和谷胱甘肽(GSH)，酶促抗氧化系统主要有超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、谷胱甘肽还原酶(GR)。ASA-GSH循环参与种子萌发过程，在种子引发过程中具有重要的抗氧化作用。Chen等[60]研究发现，引发处理后萌发种子表现出ASA-GSH循环的增强。在干旱胁迫下，种子引发通过提高种子发芽势、促进快速成苗进一步增强ASA-GSH循环，增强植物的抗旱能力。种子引发能够增强酶促抗氧化系统，该系统通过减少超氧化物和过氧化物等自由基的产生，清除ROS，维持植物体内ROS代谢的动态平衡，保护植物免受胁迫威胁。大量研究表明，干旱胁迫下种子引发提高SOD、CAT、APX等酶的活性，减少活性氧的产生，减轻膜脂过氧化作用，提高植物的抗旱能力[21,55,61-62]。

2.1.3激素调节

干旱胁迫引起植物体内激素失衡，影响植物正常的生长发育。激素调节是植物响应干旱胁迫做出的最初反应之一。种子引发可以调节信号分子和植物激素的水平，从而影响它们在发芽过程中的相互关系和交叉感应，进一步影响它们的生长、发育和胁迫耐受性[63]。ABA被认为是应对干旱胁迫最有效的植物激素之一。研究证明，种子引发增强了干旱胁迫下植物内源性ABA的产生，调节植物水分状况，抵抗氧化损伤。Tayyab等[61]研究发现，使用茉莉酸甲酯引发增加了植物内源ABA的含量，增强了玉米幼苗的抗旱性。Xiong等[64]的研究同样报道了种子引发能够提高油菜幼苗内源ABA的水平，并通过增强抗氧化系统降低了活性氧的含量，抵御了水分胁迫对植物幼苗的伤害。然而，上述这些研究仅涉及种子和幼苗活力的基本生理生化指标，对于种子引发的干旱响应信号传导途径还需要做进一步的研究。

2.2 分子机制

2.2.1种子引发与胁迫记忆

发芽种子胁迫耐受性的增强是种子引发诱导的交叉耐受性的表现[65]。胁迫耐受性是通过两种策略实现的。策略一，种子引发启动了许多与发芽有关的代谢活动，如能量代谢的增强，早期贮藏物质的动员，胚芽扩张和胚乳弱化[60,66-67]。这些代谢活动促进了干燥的静态种子向发芽状态的转变，并提高了发芽潜力。策略二，引发对种子施加非生物胁迫，该胁迫抑制胚根突出，刺激胁迫响应，诱导交叉耐受。这两种策略共同构成了种子的“胁迫记忆”，可以在以后的胁迫中募集，介导发芽种子更强的耐受性[65,68]。胁迫记忆指植物遭受胁迫后发生的遗传生化变化或修饰，并在随后的胁迫中表现出相同的反应[69]。引发将会在植物体内留下胁迫记忆，帮助其抵抗各种胁迫。随着胁迫的开始，植物体内与胁迫相关的代谢网络被迅速激活，这共同形成了一种胁迫抗性机制[65]。胁迫记忆的产生使得引发种子在萌发过程中提高了抗胁迫能力。

2.2.2表观遗传修饰

种子引发激活许多代谢过程，这些代谢过程增强胁迫耐受性[70]，改善种子活力，因此引发种子发芽期间抗旱性的增加是“胁迫记忆”的结果，这种现象对发芽种子获得干旱胁迫耐受性起着重要作用。表观遗传修饰可以解释种子引发相关的胁迫反应，如DNA甲基化和组蛋白修饰[65,71-72]，这表明表观遗传修饰是“胁迫记忆”及其相关的干旱胁迫耐受性的关键点。研究指出，甲萘醌亚硫酸氢钠(MSB)引发调节渗透胁迫下植物脯氨酸代谢控制基因的表观遗传变化。MSB引发导致参与脯氨酸生物合成(P5CS1)和降解(ERD5)的基因启动子区的低甲基化。这导致基因P5CS1上调和ERD5下调，使得脯氨酸积累量增加。在成年植株中，胁迫引起DNA序列的一些变化，这与MSB在植物基因P5CS1上游区域留下的表观遗传印记相似[73]。Kubala等[74]研究发现，干旱胁迫下种子引发使得编码组蛋白乙酰基转移酶HAG2基因上调。

3 小结与展望

近些年来，随着种子引发技术研究的不断深入，种子引发技术日臻完善，也取得了不错的研究成果。然而，该技术也存在一定的问题。种子引发后的回干过程会影响种子内部不同的生理生化过程，降低种子的寿命和活力。引发期间长时间的种子处理导致种子耐受性的丧失。此外，种子引发后的贮藏条件，如温度，湿度，空气成分等，也会对种子活力产生负面效应，导致贮藏能力下降，寿命缩短，甚至增加种子表面污染菌数。尽管新的种子引发技术不断涌现，然而真正用于大规模商业化生产的种子引发技术并不多，更多的是传统引发技术。在实际应用中，种子引发应该考虑品种特性和引发效果，选择适宜的引发剂。引发剂的选择应该综合考虑地区环境条件因素，种植作物种类，引发效果及成本，达到降低成本，提高抗逆能力，增加产量，获取最大利益的目的。

随着生物学技术的快速发展，种子引发技术内在机理和引发效果的研究都取得一定的结果。未来的研究可以结合转录组、代谢组、蛋白质组等组学技术，进一步深入研究不同种子引发机理，掌握引发规律。由于引发技术存有一定的局限性，因而有必要寻找克服引发技术缺陷的方法，完善种子引发的控制技术，进一步研究引发种子的贮藏技术。继续投入新型种子引发技术的研究，逐渐推进新型引发技术商业化应用。对于种子活力丧失严重或种子活力低的种子，维持种子活力是关键，而利用种子引发技术或许能够恢复或提高种子活力。种子引发技术可作为抢救和保护种质基因库濒危种质的有效途径，确保种质遗传稳定性。