精准医疗时代下超声靶向微泡破坏技术研究与应用

2021-12-01 02:32杨国良杨君唐君辉刘政

医学综述 2021年24期

杨国良，杨君，唐君辉，刘政

(陆军军医大学第二附属医院超声科，重庆 400037)

精准医疗是以个体化医疗为中心，应用各类医学前沿技术实现精准诊断与靶向治疗的新型医疗模式，自2015年提出即在世界范围内引起广泛关注，在此背景下超声靶向微泡破坏技术(ultrasound-targeted microbubbles destruction，UTMD)应用不断兴起[1]。该技术是一种安全物理靶向治疗方式，以微泡壳或核为载体包裹药物或基因等物质，经静脉注射后行超声观察微泡进入靶区并予以一定条件下辐照，使微泡发生空化效应产生破裂，从而达到定点释放的目的，同时其产生的声孔效应可短暂对靶组织区域细胞膜形成小孔，改变靶区组织结构及性质，增加组织细胞的通透性，使药物、基因治疗物质更易进入细胞内，进一步促进该处药物吸收及其他外源性药物的靶向运输，加之微泡本身具备精准成像功能，即在分子水平实现疾病显影诊断的同时进行靶向治疗，契合了精准医疗背景下个体化医疗与精准给药等关键问题[2]。现就UTMD技术特性、作用机制、技术应用、安全性以及不足等方面进行综述。

1 微泡技术特性

UTMD技术核心即微泡，通过改变微泡的各种参数(如微泡大小、种类、外壳材质、核心气体、靶向配体与传递物质)可以增强治疗效果[3]，如微泡粒径大小可以决定显影部位，壳膜材料与修饰物决定稳定性及靶向功能，以及改变或调解相关参数以适应更多应用场景。

1.1结构构成现代微泡绝大多数由气核和外壳两部分组成[4]。气核一般是具有低溶解性的惰性气体，如全氟化碳、全氟丙烷。早期研究使用氧气、氮气等气体作为微泡的气核，但因可溶性高，经静脉注入微泡后扩散明显从而无法在血液中达到稳定且长时间存留。利用全氟化碳等重气体溶解度低的特性，能显著延长微泡在血液中的稳定性和存留时间[5]。外壳需具有较好的稳定性[6]，如磷脂壳外表面具有较好的亲水性，内表面又具有亲油性，能够形成稳定气核单涂层；脂类壳具有高度的顺应性，易于在超声激励下发生膨胀、压缩、破碎和重新封装，且脂类壳还有多样的选择性，可与基因、药物、蛋白质及其他化合物质结合；蛋白质壳以白蛋白作为微泡膜材料，具有安全无毒、易于制备等优点，多用于增强超声显像与转运靶向配体DNA等方面[7-8]。传统微泡直径多为1～8 μm，而纳米微泡的粒径更小，为10～200 nm，纳米微微泡又分为纳米粒、纳米液滴、纳米泡与声敏脂质体[9]，可通过血管间隙直接进入病变处组织内进行显像，弥补了微米级别的微泡不能穿过血管内皮屏障的劣势。

1.2微泡制备利用不同壳膜材料、气体核心、靶向修饰物在不同条件参数下制备微泡，使其具备多种功能及应用于不同场景。微泡制备原理主要分为两类：一是将药物或基因与微泡膜壳材料混合一并制备来制作荷载微泡；二是利用静电吸附原理将带负电药物或基因吸附在阳离子脂质或阳离子聚合物为膜壳的微泡表面[10]。制备方法又细分为机械搅拌法、复乳溶剂蒸发法、探针超声法、喷雾干燥法、薄膜水化法等。机械搅拌法主要用于制备声学活性微泡和磷脂壳微泡；复乳溶剂蒸发法主要用于制备聚合物壳微泡，同样可以制备磷脂壳微泡；探针超声法主要制备蛋白质外壳结构微泡，此类微泡外壳有较好的稳定性；喷雾干燥法可制备蛋白质、磷脂及聚合物等微泡壳；薄膜水化法适用于微泡膜中含有脂质、硬脂酸盐、聚乙二醇等成分的微泡制备[11-13]。

1.3微泡优势利用微泡作为载体携带治疗药物或基因等物质转运至靶区具有多种优势，理想情况下的微泡需具备以下条件：①安全低毒和低免疫原性，微泡可随机体代谢排出体外且不会对正常代谢循环产生影响，能够降低全身给药的毒性，减少全身反应，降低免疫原性反应[14]；②运转稳定和重复性高，微泡在机体内能够顺利通过体、肺循环且在运转过程中保持良好的稳定性以及较高可重复性[15]；③具有良好的特异性和靶向性，利用各类壳、膜材料及不同制备方法予以靶向功能来修饰微泡，以携带不同药物或基因等物质，使其具备主动靶向或被动靶向的功能[16]；④成像效果良好且稳定，能够提高灰阶图像及多普勒信号，达到提升显影质量以及减少衰减尾像的效果；⑤容易制备及保存，载药微泡制作工艺相对容易，存贮环境要求不高且随用随配。经静脉注射操作简单且对机体创伤较小；以常规诊断超声为辅，可边诊断边治疗，中间步骤少，实现目标靶区域的成像与递送药物一体化，满足诊疗一体化基本要求[17]。

2 UTMD的可能机制

利用微泡作为有效载体包裹药物、基因等递送至靶区并给予超声辐照，使微泡发生“爆破”，从而实现精准递送。此过程有热效应、空化效应、声孔效应、细胞膜转运与炎症反应、声辐射力等共同作用，使组织内细胞结构产生一系列改变，从而促进微泡所荷载的治疗物质到达目标区域[18]。

2.1热效应超声所产生的声波在介质中传播引起质点震动和质点间摩擦，使介质温度升高的作用即为超声热效应[19]，热效应在UTMD中应用主要表现为促进靶区血液循环、增加动能、促进药物扩散与吸收等。Chen等[20]研究显示，热效应能够增加血管通透性，使细胞内氧自由基增多，间接提高细胞膜通透性。超声所产生的热效应还会使细胞膜升温，能够改变细胞膜表面的磷脂流动性，协同提高细胞膜通透性，以促进靶区域组织细胞摄取药物，但同时随着声强或频率等参数的增加使介质或组织温度相应升高，其可能影响所荷载治疗物质的活性甚至引起靶区组织细胞损伤，因此应用UTMD技术进行诊疗时，需选择合理参数以避免治疗物质失活及热损伤。

2.2空化效应液体中微气泡在不同强度声场负压相中产生空化效应，又分为瞬态空化和稳态空化。瞬态空化是指微泡在一定强度声场下极短时间内发生微泡急剧压缩破裂并产生高温、高压、微射流和冲击波，牵拉血管内皮细胞并增大细胞间隙；稳态空化是指微泡在低频超声负相声场中开始膨胀，而后在正相声场中收缩，反复震荡至“爆破”产生一定的辐射压与微射流，增加细胞膜的通透性[21]。空化效应是UTMD技术的关键，无论是瞬态空化还是稳态空化都能够促进载药微泡向血管外靶组织区域释放，但同时微泡的半径、气核、壳膜、超声参数、环境压力、介质表面张力、温度等参数均可以影响空化效应的效果[22]。因此要实现UTMD技术的最佳效果，仍需大量工作来调试众多参数，以达到最佳匹配条件。

2.3声孔效应微泡发生空化效应所产生的化学、机械及热效应可损伤血管内皮细胞和细胞膜，使细胞膜表面形成可逆性细小开口，开口因孔径不同可持续数秒至数十秒，细胞间隙增宽又使细胞通透性增加，进一步促进药物进入靶区域组织细胞内[23]。研究显示，在相同微泡条件下瞬态空化在细胞膜上产生的声孔持续时间较稳态空化更长，且恢复时间更长，但两种效应均能促进微泡所荷载药物进入靶区组织，增加药物浓度[24]。声孔效应是在微泡发生空化后所产生的一系列改变中最重要的效应之一，也是UTMD能够靶向递送的关键机制。

2.4细胞膜转运与炎症反应超声辐照微泡可刺激细胞吞噬功能，在过氧化氢的作用下促进钙离子内流，而后钙离子所需钾离子的通道开放，刺激细胞膜转运，增加细胞摄取药物，而微泡在转运过程中阻挡酶对微泡壁有效荷载的破坏，同时钙离子内流还可以促进细胞包吞作用。Lentacker等[25]研究显示，微泡震动过程中可使流场产生声微流，细胞膜产生形变以致细胞骨架重新排列，机械感应器对下游信号通路产生影响，刺激细胞内吞及分泌作用。此外因组织受损，体内启动炎症反应机制，大量T淋巴细胞与巨噬细胞等在靶组织区域聚集，从而对受损组织进行清除和修补。炎症反应与细胞膜转运共同促进治疗物质向靶区递送，进而完成一系列高精度递送药物过程。

2.5声辐射力超声波在介质中传播时产生作用力使介质中的微粒沿声波方向发生位移，吸收声波后的微粒作为第二声源，使周边微粒发生共振或相互吸引。Zhao等[26]发现在声辐射力作用下，血管内微泡会更多停留在辐照点位置，因此声辐射力作用可驱动微泡向血管内壁靶点位置黏附、集聚。Frinking等[27]将声辐射力与肿瘤靶向造影剂BR55联合应用于小鼠前列腺癌模型以研究超声成像效果，结果显示声辐射力能够使肿瘤与靶向造影剂结合更紧密，产生的图像效果更清晰。表明声辐射力可以协助提高成像效果与诊疗精准度，有望成为超声分子影像未来发展的方向。

3 UTMD技术的应用

UTMD技术实现精准治疗与无创诊疗的基础是通过超声微泡造影剂荷载治疗物质递送至靶区组织或器官，在超声辐照的作用下定点释放，从而达到诊疗目的。而微泡所能荷载递送的治疗物质种类繁多且治疗应用领域广泛，目前多用于肿瘤、心脑血管疾病、开放血脑屏障等方面。

3.1药物递送 UTMD技术能够高效率运输与定点释放荷载药物，不仅能提高靶区组织药物浓度，还可明显降低药物的毒副作用。早期研究多集中在血管内游离药物递送，利用超声激励微泡并产生强烈的空化效应以促进血管内游离药物向靶区域组织递送，提升靶区药物浓度，提高治疗效果，其中较为典型如Yoshida等[28]将阿霉素药物加入到人单核细胞淋巴瘤U937的细胞培养液中并用超声进行辐照，结果显示经辐照后的细胞药物摄取率和死亡率均明显增加。而孟庆齐等[29]利用低强度超声联合阿霉素治疗人白血病细胞株K562/A02小鼠模型，结果显示低强度超声在不改变细胞膜P糖蛋白表达的情况下，能提高K562/A02细胞内阿霉素浓度，促进细胞凋亡。超声增强游离药物递送的主要机制是空化作用发生的声孔效应增加细胞膜的通透性从而达到增强药效的目的，但游离药物联合超声递送的缺点是无法判断药物在靶组织区域的分布情况。

3.1.1微米级载药微泡为了弥补游离药物递送方法的不足，研究人员开始将治疗物质荷载至超声造影剂上，并利用超声空化效应在靶区击破微泡以达到增加靶区药物浓度的目的。如易品诗等[30]利用穿膜肽和基质细胞衍生因子-1修饰的载多西紫杉醇超声造影剂应用于兔VX2舌癌颈淋巴转移模型，证实经穿膜肽和基质细胞衍生因子-1修饰微泡的肿瘤抑制率和肿瘤细胞凋亡率明显高于空白微泡组和单纯药物组，为临床治疗舌癌颈淋巴结转移提供了参考。燕翼等[31]采用“生物素-亲和素”桥接法制作携带唾液酸化路易斯靶向微泡和同型对照微泡，注射到心肌缺血再灌注小鼠模型，结果显示，与对照微泡相比，携带唾液酸化路易斯靶向微泡可以显著增强心肌缺血区域显影，证明载药微泡对心肌缺血再灌注损伤的组织具有靶向探查的优势。唐勇等[32]应用低频超声与载链激酶微泡造影剂共同作用于体外血栓模型，结果显示溶栓药物不仅对微泡稳定性影响轻微，且可明显促进深静脉血栓溶解。但以上研究所构建的载药微泡直径多为微米级，不仅载药量有限，其稳定性受环境、温度、参数等条件的限制，所以研发兼具荷载量大、稳定性强的载药微泡成为亟待解决的问题。

3.1.2纳米级微泡载体复合物尽管载药微泡可以充当药物载体，同时还可以作为空化核达到促进空化效应的目的，但微米级载药微泡存在荷载药量少以及稳定性差等弊端。针对此类问题，凌茜[33]利用亲和素-生物素法将生物素抗6次跨膜前列腺上皮抗原抗体1与生物素纳米微泡链接，成功制备出荷载前列腺上皮抗原抗体1靶向纳米微泡造影剂，通过对微泡表面修饰，该造影剂可在体外与前列腺PC3细胞特异性靶向结合，具有高靶向性及增强显像的作用。罗婉贤等[34]利用天然大分子肝素荷载紫杉醇制备出具有高载药性、高穿膜作用的纳米级微泡，并证实该纳米微泡对人乳腺癌细胞MCF-7具有敏感的抗肿瘤活性，能更好地发挥抗肿瘤药物的作用。因此，与常规微米级微泡相比，纳米级微泡复合物在载药量与稳定性上均有所提升。

3.2基因递送基因治疗是将正常基因细胞导入靶区域组织细胞以纠正或补偿异常或缺陷基因以达到治疗疾病的目的。UTMD技术可以协助将基因安全且高效地导入靶区细胞并促进其表达转染，目前有以下几种方法。

3.2.1基因导向性酶前提体药物治疗也称为药物前体激活基因治疗或自杀基因治疗，其原理是将细菌、病毒等基因导入靶区肿瘤细胞内，通过该基因编码特殊的酶，将无毒性的药物前体催化成细胞毒性物质，干扰细胞DNA合成，达到肿瘤细胞凋亡的目的，以单纯疱疹病毒胸苷激酶、腺病毒联合丙氧鸟苷、胞嘧啶脱氨酶和5-氟胞嘧啶自杀基因系统最为常见。Li等[35]研究发现在乳腺癌的基因治疗中，运用UTMD联合微泡介导单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷和胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶在MCF-7细胞中进行表达转染，其腺病毒介导的血管内皮生长因子受体启动子能够驱动自杀基因在MCF-7细胞中产生特异性表达，具有协同杀伤肿瘤的作用。基因导向性酶前提体药物治疗方法因高转染率及强大的肿瘤杀伤作用，成为当前研究的热点。

3.2.2基因替代基因替代是指将抑癌基因转染给肿瘤细胞，以纠正基因缺陷达到治疗目的，也称为替代性基因治疗。Guo等[36]将抑癌基因p53联合微泡造影剂，经超声引导下对乳腺癌大鼠进行瘤内注射并实施超声激励，结果显示肿瘤细胞大量退行性坏死，肿瘤细胞生长抑制率高达62.62%，与单独p53基因导入组相比，p53基因导入+超声造影剂+超声激励组p53表达更高，能够引起肿瘤细胞阻滞在G2期并诱导细胞凋亡。刘海艳[37]以UTMD技术增强野生抑癌基因wtp53转染鼠胶质瘤C6细胞来抑制肿瘤发展，结果转染细胞中的wtp53信使RNA表达量增多，流式细胞仪分析细胞凋亡百分比明显增高且wtp53基因表达稳定。UTMD技术为胶质瘤的基因治疗提供了新方向，同时也证明了以基因荷载的微泡在超声作用下发挥协同和激励的作用。

3.2.3RNA干扰 RNA干扰是指具有同源双链RNA触发转录功能后的基因沉默现象，该现象可引起该基因编码信使RNA降解来抑制其功能，但细胞摄取率极低且稳定性差，限制了RAN干扰技术的应用。Zhao等[38]研究发现，通过UTMD技术联合叉头框蛋白A1转染干扰小RNA荷载卟啉微泡治疗乳腺癌具有良好的治疗效果，低频超声联合微泡可以促进干扰小RNA转染与卟啉摄取，表明超声联合微泡辐照能够提高双链RNA的摄取率及体内血液递送的安全性。Zhang等[39]利用UTMD为介质，构建短发夹RNA与促黄体激素释放激素类似物合成靶向微泡，应用于卵巢癌培养细胞中并加以超声辐照，结果显示超声靶向微泡提高了RNA干扰效率，且卵巢癌A2780/DDP细胞凋亡率和细胞增殖抑制率明显增高。目前RNA干扰在肿瘤研究中已表现出巨大的潜力，有望成为肿瘤基因治疗的新方向。

3.3细胞递送干细胞、免疫细胞是近年来的研究热点，同样UTMD技术也可以携载治疗细胞，目前研究领域主要集中于肿瘤及心血管疾病。Li等[40]以间质干细胞荷载微泡造影剂，应用于心肌梗死模型小鼠并实施超声辐照，结果显示联合治疗组间充质干细胞的归巢数量显著增加，证实了UTMD技术可以有效介导干细胞递送且能改善治疗效果。贾启明等[41]利用UTMD技术沉默T淋巴细胞的Itch基因表达，构建出靶向纳米微泡，对胃癌MFC细胞进行免疫治疗，结果显示该方法能够有效抑制Itch基因的表达，从而增强T淋巴细胞活性，提高对胃癌MFC细胞的免疫杀伤效率。

3.4开放血脑屏障中枢神经系统疾病药物治疗效果不佳的主要原因是药物无法跨越血脑屏障，但UTMD技术能够可逆性地开放血脑屏障。崔海[42]利用伊文蓝荷载微泡造影剂，经健康SD大鼠颞骨予以超声辐照，结果显示UTMD技术可以安全、有效且可逆地靶向开放大鼠单侧血脑屏障。蔡文斌等[43]利用生物素-亲和素方法将干扰小RNA与纳米微泡进行荷载，制备出干扰小RNA-纳米微泡复合体，并应用UTMD技术靶向治疗胶质母细胞瘤，证实干扰小RNA-纳米微泡复合体联合UTMD技术可以有效抑制胶质瘤细胞的活性并提高肿瘤细胞的凋亡率，实现了胶质瘤的非创伤性治疗。该研究证实了开放血脑屏障并进行靶向递送治疗中枢神经系统疾病的可行性，在一定程度上解决了药物经静脉注射无法通过血脑屏障的问题，为胶质瘤的非侵入性治疗提供了新思路。

4 UTMD技术的安全性与不足

UTMD技术具有高度特异的靶向性和安全无创性，具有广阔的应用前景，但尚存在至少以下两方面技术难题。

4.1安全性虽然UTMD技术在肿瘤、心血管疾病及中枢神经系统疾病中取得较大进展，但目前国内外文献关于UTMD技术安全性的结论大多体现在动物实验或细胞水平层面，其安全性仍需要进一步探讨。如超声辐照能量过大对靶区细胞增殖有一定的抑制作用，对细胞膜也有一定程度的损伤，在高强度超声辐照下微泡的空化也可能导致动物模型内皮细胞坏死、组织出血及溶血，既往研究显示，应用UTMD靶向治疗心脏疾病时，其他器官如肺、肝、肾和肌肉也会出现不同程度的损伤[44-45]。超声微泡在打开血脑屏障的同时也可能造成脑损伤，在空化作用及声孔效应的作用下，微泡的爆破不仅能够打开血脑屏障，实现释放药物或基因，还可破坏脑毛细血管内皮细胞，导致血脑屏障的损伤。张留影[46]在低强度超声联合微泡开放大鼠血脑屏障的研究中提出，低强度超声所引起的空化作用等一系列声学效应导致热激蛋白水平升高，提示可能出现无菌性炎症反应。此外，超声微泡联合递送药物还可能导致其他并发症，董倩等[47]利用超声联合替莫唑胺载脂体微泡应用于大鼠脑胶质瘤模型中发现，经治疗后瘤体周围存在广泛脑组织损伤及瘤体内部出血，同时出现大鼠活动受限及靶区皮肤毒性等一系列不良反应。因此，超声与微泡联合药物或基因进行超声治疗的安全性需要引起广泛关注及重视。

4.2技术不足目前UTMD技术最佳参数仍在探索中，各类参数错综复杂又环环相扣。以超声为例，其中频率、占空比、声强、辐照方法、总辐照时间等主要声学参数影响微泡发生一系列效应。而微泡类型、大小，浓度、外壳材质、包裹气体等参数又间接影响声学参数调整。参数优化及微泡类型又对治疗效果或转染效率至关重要。例如声学参数设置偏低，易导致治疗效果不理想或转染率下降；声学参数设置过高又会引发过度的热效应从而导致毛细血管损伤，甚至烫伤、误伤、微血栓等不良反应[48]。除声学参数及微泡参数外，还与靶区域组织细胞学类型有关，如根据不同癌灶组织细胞学的类型及是否为多重耐药细胞株等实际情况，选择不同理化性质的靶向微泡及声学参数，以达到最佳治疗效果[49]。另外，靶区域肿瘤组织的大小、位置、深度、侵犯周围程度同样影响各类参数调整，所以优化UTMD技术仍需要开展大量实验和研究以实现最佳参数匹配。

超声微泡诊断技术因精准诊断的特性已在临床广泛应用，但微泡介导靶向治疗技术目前仍面临以下问题需要解决：①微泡制备工艺仍有较大提升空间，首先微气泡大小直径不均匀是导致超声空化不完全、不稳定的重要原因之一，因而制备出粒径均匀的微泡对于优化超声参数，达到稳定的空化效果尤为重要；其次是微泡稳定性，如气核与微泡在血液中存留时长密切相关，外壳则直接影响微泡在声场中顺应性，气核与外壳共同影响微泡膨胀、碎裂、重新密封与压缩等每一个声学周期。如何制备出粒径均匀且稳定的微泡是UTMD技术亟待解决的问题之一。②荷载量与吸收率，通常磷脂及其他类型外壳微泡的载药量<1%，即使利用阳离子高分子聚合物聚乙烯亚胺为载体制作微泡也难有质的提升[50]。如果单纯以增大微泡粒径以加大荷载量则难以穿透血管内膜屏障到达组织间隙，使治疗物质仅在靶组织区域血管内释放，难以达到最佳治疗效果[11]。③可控的基因表达，Farhadi等[51]以中空蛋白为载体制作纳米微泡，利用UTMD技术将多条基因转录至小鼠细胞内使其表达，小鼠体内注射癌细胞以诱导肿瘤生成，利用超声造影成像功能，成功观察到肿瘤组织中空蛋白基因表达，实现了靶向基因技术可视化。但同时也存在基因表达不完全稳定、表达效率不高以及可视化成像模式与其他成像模式结合等难题。

5 展望