白芍总苷对糖尿病所致心肌损伤的保护作用及机制研究

王振贤 王立哲

糖尿病心肌病是由长期高血糖所导致的心肌组织结构病变和功能损伤，是糖尿病患者最常见的并发症，也是导致其心力衰竭、心源性休克甚至死亡的主要因素之一[1-2]，因此防治糖尿病心肌病对糖尿病患者具有积极意义。近年来研究发现，炎症反应和心肌纤维化在糖尿病心肌病并发症发生、发展过程中发挥着重要作用[3-4]。白芍总苷（total glucosides of paeony,TGP）是中药白芍中提取的一类活性化合物，包括芍药苷、羟基芍药苷、芍药内酯苷等成分，具有良好的抗炎活性并对腹膜、肝纤维化具有显著的抑制作用[5-7]。本研究通过腹腔注射链尿佐菌素联合高脂饲料喂养制备糖尿病心肌病大鼠模型，探讨TGP对糖尿病所致心肌损伤的保护作用及机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物 健康、清洁级雄性SD大鼠120只，体质量（220±20）g，均购自河北省实验动物中心[SYXK（冀）2018-004]。

1.2 药物与试剂 TGP胶囊购自宁波立华制药有限公司（批号：20190517，规格：0.3 g/粒）；盐酸二甲双胍片（metformin，Met）购自天津亚宝药业科技有限公司（批号：190731，规格：0.3 g/片）；HE、Masson染色试剂盒和ELC超敏发光试剂盒均购自南京建成生物工程研究所（批号：191219、191124、200107）；TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA试剂盒均购自北京索莱宝生物科技有限公司（批号：SEKR-0009、SEKR-0002、SEKR-0005）；Toll样受体 4（TLR4）、髓样分化蛋白（MyD88）、NF-κB抗体和IgG二抗均购自北京博奥森生物科技有限公司（批号：bs-20594R、bs-1047R、bs-23217R、bs-0294P）；BCA试剂盒、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶试剂盒均购自北京康为世纪生物科技有限公司（批号：CW0014、CW0022M）。

1.3 主要仪器 Sure Step Plus型血糖仪购自美国强生公司；Vevo2100型动物超声仪检测购自加拿大Visual Sonics公司；HM340E石蜡切片机购自德国Thermo Scientific公司；Allegra 21R型低温离心机购自美国Beckman公司；RT-6100型酶标仪购自美国Rayto公司；DYCZ-24DN型电泳仪、DYCZ-40D型转膜仪均购自北京六一生物科技有限公司；Chem Doc XRS型凝胶成像仪购自美国Bio-Rad公司。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组、模型制备与给药 将120只大鼠按随机数字表法分为 Met组（200 mg/kg）[8]、TGP 低、中、高剂量组（50、100、200 mg/kg）组[9]、模型组和正常对照组，每组20只。除正常对照组外，其余各组大鼠均采用一次性腹腔注射链尿佐菌素（65 mg/kg）联合高脂饲料喂养8周的方法制备糖尿病心肌病大鼠模型，造模成功标准参照文献[10]。自造模第1天开始，Met组1次/d 40 mg/ml的Met溶液灌胃（灌胃体积5 ml/kg），TGP 低、中、高剂量组分别 1次/d 10、20、40 mg/ml的TGP溶液灌胃（灌胃体积5 ml/kg），模型组和正常对照组同步予0.9%氯化钠溶液灌胃（灌胃体积5 ml/kg），疗程8周。

1.4.2 各组大鼠FPG水平和心功能指标检测 给药8周后，各组随机取10只大鼠，于清晨空腹采集尾静脉血，用血糖仪检测FPG水平。用动物超声仪检测心功能指标：左心室舒张末期内径（LVIDd）、左心室收缩末期内径（LVIDs）、射血分数（EF）、每搏输出量（SV），连续测量5个心动周期，取其平均值。

1.4.3 各组大鼠心肌组织病理学改变和纤维化程度观察 上述大鼠麻醉后开胸取心脏，切取左心室置10%甲醛溶液中固定3 d，石蜡包埋后5 μm厚度连续切片，二甲苯透明和梯度乙醇脱蜡水化后：（1）行HE染色，梯度乙醇脱水和透明处理后中性树胶封片，显微镜下观察心肌组织病理学改变；（2）参照Masson染色试制盒操作说明书处理，显微镜下观察心肌纤维化程度（肌纤维呈红色，胶原纤维呈蓝色）。

1.4.4 各组大鼠血清炎症因子含量检测 取各组剩余的10只大鼠，麻醉后经腹主动脉取血，2 000 r/min离心10 min取血清，参照ELISA试剂盒操作方法检测血清 TNF-α、IL-1β、IL-6 含量。

1.4.5 各组大鼠心肌组织蛋白表达水平检测 采用Western blot法。上述大鼠取血完成后开胸取心脏，切取左心室心肌组织剪碎后加入9倍量冷裂解液充分裂解，4℃、12 000 r/min离心20 min后取上清液，然后参照BCA试剂盒说明书检测总蛋白浓度、95℃水浴使蛋白变性后，经SDS-PAGE胶电泳分离、转膜、5%蛋白免疫印迹封闭液室温封闭2 h，滴加目标蛋白、β-actin抗体4℃孵育12 h，PBS溶液洗膜后滴加二抗37℃孵育1 h，PBS溶液洗膜后滴加ELC发光试剂后，通过凝胶成像仪显示蛋白条带，以β-actin为内参、通过条带灰度值半定量目标蛋白表达水平。

1.5 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠FPG水平比较 与正常对照组比较，模型组大鼠FPG水平明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，Met组和TGP中、高剂量组FPG水平均明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。见表 1。

表1 各组大鼠FPG水平比较（mmol/L）

2.2 各组大鼠心功能指标比较 与正常对照组比较，模型组大鼠LVIDd、LVIDs均明显升高，而EF、SV均明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.01）；与模型组比较，Met组和TGP中、高剂量组LVIDd、LVIDs均明显降低，而EF、SV均明显升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与Met组比较，TGP高剂量组LVIDs明显降低，EF、SV均明显升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠心功能指标比较

2.3 各组大鼠心肌组织病理学改变 正常对照组大鼠心肌纤维排列整齐规则，细胞形态正常、结构完整，着色均匀；模型组可见心肌纤维断裂、排列紊乱，细胞呈空泡变性，可见大量炎性细胞浸润；与模型组比较，Met组和TGP低、中、高剂量组心肌纤维和细胞病变呈不同程度改善，其中TGP高剂量组未见心肌纤维断裂，炎性细胞浸润数量明显减少。见图1（插页）。

图1 各组大鼠心肌组织病理学改变[a：正常对照组；b：模型组；c：二甲双胍（Met）组；d：白芍总苷（TGP）低剂量组；e：TGP 中剂量组；f：TGP高剂量组；HE染色，×200]

2.4 各组大鼠心肌纤维化程度改变 正常对照组大鼠心肌可见肌束平行方向的胶原纤维，含量适宜、分布均匀；与正常对照组比较，模型组蓝染胶原纤维明显增多，排列紊乱，分布不均、以血管周围含量较多；与模型组比较，Met组和TGP低、中、高剂量组心肌纤维化呈不同程度减轻，其中以TGP高剂量改善最为明显。见图2（插页）。

图2 各组大鼠心肌纤维化程度改变[a：正常对照组；b：模型组；c：二甲双胍（Met）组；d：白芍总苷（TGP）低剂量组；e：TGP中剂量组；f：TGP高剂量组；Masson染色，×200]

2.5 各组大鼠血清炎症因子含量比较 与正常对照组比较，模型组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量均明显升高，差异均有统计学意义（均P＜0.01）；与模型组比较，Met组和TGP中、高剂量组 TNF-α、IL-1β、IL-6含量均明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.01）；与 Met组比较，TGP高剂量组TNF-α、IL-6含量均明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。见表3。

表3 各组大鼠血清炎症因子含量比较（pg/ml）

2.6 各组大鼠心肌组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达水平比较 与正常对照组比较，模型组大鼠TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达水平均明显上调，差异均有统计学意义（均P＜0.01）；与模型组比较，Met组和TGP中、高剂量组TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达水平均明显下调，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与Met组比较，TGP 高剂量组 TLR4、MyD88、NF-κB 蛋白表达水平均明显下调，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见图 3、表 4。

表4 各组大鼠心肌组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达水平比较

图3 各组大鼠心肌组织Toll样受体4（TLR4）、髓样分化蛋白（MyD88）、NF-κB 蛋白表达的电泳图[a：正常对照组；b：模型组；c：二甲双胍（Met）组；d：白芍总苷（TGP）低剂量组；e：TGP 中剂量组；f：TGP 高剂量组]

3 讨论

糖尿病心肌病是糖尿病最常见的并发症，以心肌细胞肥大和心肌纤维化为主要病理特征，可导致心肌收缩功能障碍进而引发心力衰竭、心源性休克甚至致残、致死，约占Ⅱ型糖尿病死亡数的80%[11]。Wu等[12]研究发现持续高血糖刺激炎症细胞因子大量释放是导致心肌纤维化发生、发展的重要机制。因此，以抑制炎症反应及心肌纤维化为治疗靶点对防治糖尿病心肌病至关重要。

近年来，随着国家中医药发展战略的实施与深入，中医药治疗糖尿病逐渐得到医生和患者的关注与认可。中药白芍以毛茛科植物芍药的干燥根入药，味苦、性寒，具有养血调经、敛阴止汗、平抑肝阳之功效。TGP为白芍的主要活性成分，具有良好的抗炎活性和抗纤维化作用[5-7]；曹秋夏等[13]研究发现TGP能够通过抑制炎症反应和肾间质纤维化而对糖尿病大鼠肾脏起到保护作用。本实验研究结果发现，糖尿病模型大鼠呈现心肌纤维断裂、细胞空泡变性、炎性细胞浸润等病理性改变以及血管周围较多见的心肌纤维化，这与刘金岩等[14]研究报道一致；给予TGP治疗8周能够明显降低糖尿病大鼠FPG水平，明显改善心功能指标（降低LVIDd、LVIDs并提高EF、SV），改善心肌纤维和细胞形态结构病变并降低心肌纤维化程度，并且TGP高剂量组对心功能指标和心肌病变的改善作用优于Met组，提示TGP对糖尿病大鼠心肌结构和功能具有保护作用。

持续高血糖将刺激心肌细胞大量释放炎症细胞因子和趋化因子等，TNF-α、1L-6、IL-1β 不但能够介导炎症反应而导致心肌损伤，并且能够刺激粒细胞等进一步合成与释放炎症因子引发炎症级联反应而逐渐加重心肌损伤[15]。TLR4在心肌组织中广泛表达并参与心肌炎症的调节[16]，TLR4被激活后能够活化MyD88炎症通路；另外，TLR4/MyD88通路能够间接激活NF-κB，而 NF-κB 则能够刺激 TNF-α、1L-6、IL-1β 转录表达，从而加重炎症反应[17]。本研究结果发现，给予TGP治疗8周能够明显降低糖尿病大鼠血清TNF-α、1L-6、IL-1β 水平，降低心肌组织 TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达水平，提示TGP具有抑制糖尿病大鼠心肌炎症反应的作用，可能与抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路有关。

综上所述，TGP对糖尿病大鼠心肌结构和功能具有保护作用，其机制可能与抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路进而抑制炎症反应有关。