弥漫大B细胞淋巴瘤中外泌体的研究与应用进展

王悦，王树叶

(哈尔滨医科大学附属第一医院血液内科，哈尔滨 150001)

弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)是危及生命的、有显著生物学异质性的非霍奇金B细胞淋巴瘤，占所有非霍奇金淋巴瘤的30%～35%[1-2]。虽然它是一种潜在的可治愈的恶性肿瘤，但大多数患者无法通过补救疗法(包括自体干细胞移植)治愈，约1/3的患者会发展成复发性/难治性DLBCL(relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma，R/R DLBCL)[3-4]。DLBCL的预后由患者特征、肿瘤负荷、生物学行为、肿瘤微环境和治疗效果共同决定[5]。因此，对患者结果的准确预估有助于DLBCL的个体化治疗，既往对DLBCL患者预后及治疗效果的评估通常采用国际预后指数(international prognostic index，IPI)[6]。但随着免疫治疗时代(利妥昔单抗的出现)的到来，IPI已不再具有绝对权威性，同时由于肿瘤异质性的存在，IPI相似患者的预后也可能不同。近年来，外泌体作为一种“液体活组织检查”物质被广泛研究，尤其在血液系统恶性肿瘤DLBCL方面，可通过检测患者外周血甚至体液外泌体的含量评估患者的治疗反应及预后，具有较好的临床应用价值。对于R/R DLBCL患者，外泌体在免疫治疗以及作为药物载体递送抗肿瘤药物方面的应用显示出巨大潜力。外泌体在评估患者治疗反应、预后以及探索R/R DLBCL新的治疗方法方面均有重要意义。现对DLBCL中外泌体的研究与应用进展予以综述。

1 外泌体的概述

1.1外泌体的结构 外泌体是几乎所有生物活性细胞均可产生的微小囊泡，是细胞与细胞之间通讯的关键信使[7]。外泌体是一种存在于多囊体中的分泌小泡，直径30～100 nm，能与细胞膜融合释放到微环境中[8]。在肿瘤微环境中，肿瘤细胞产生的外泌体称为肿瘤细胞衍生外泌体(exosomes derived from tumor cell，TEX)或肿瘤源性外泌体，同时肿瘤相关抗原也在外泌体上。TEX是肿瘤细胞与微环境相互作用的重要媒介，通过共享遗传信息或功能蛋白改变细胞生物学功能。TEX由肿瘤细胞、免疫细胞、基质细胞、血管和细胞外基质构成，其功能随自身构成的动态变化而变化。因此，外泌体可作为细胞排泄无用或有害RNA和蛋白质的主要途径，并可作为重要信使和载体，改变其他细胞在正常生理和疾病状态下的功能。

1.2外泌体的功能 血液系统恶性肿瘤的发生发展过程长期且复杂，受到多种机制、多种因素的共同影响，肿瘤细胞产生的外泌体在该过程中发挥重要作用，尤其在DLBCL中。

1.2.1介导细胞通讯 外泌体是生物活性细胞分泌的纳米大小的囊泡，其周围环绕脂质双层，携带多种生物分子(蛋白质、脂质、核酸等)。当外泌体被其他细胞吸收时，其所携带的多种生物分子被转运并影响受体细胞的表型，因此，外泌体被认为是细胞间通讯的重要媒介，主要通过下述3种方式发挥通讯介导作用：①不同细胞表面受体与外泌体携带的配体结合，与两个细胞相互作用时情况相似，但细胞间不直接接触。②外泌体与靶细胞膜结合，携带“新的”表面分子，获得新的黏附特性。③外泌体与靶细胞融合，交换膜蛋白和胞质溶胶。细胞间通讯是肿瘤发展和转移的关键，T细胞产生的γ干扰素能上调肿瘤细胞表达程序性细胞死亡配体1(programmed cell death-ligand 1，PD-L1)，而PD-L1镶嵌于内吞途径产生的外泌体上，并与细胞膜融合释放至微环境。含有PD-L1的较大微泡可以从细胞表面以出芽方式产生，外泌体可与肿瘤微环境中的部分细胞相互作用，也可以进入血液循环与远处细胞相互作用。值得注意的是，外泌体不仅有原发性肿瘤微环境中的局部信号，还有肿瘤向转移部位发出远程信号，以促进适宜的转移前生态位的形成，该生态位能够运输和转移生物活性分子，将在播散性肿瘤细胞到达时促进肿瘤生长[9-10]。虽然外泌体可通过细胞与细胞间的交流、胞膜与胞膜的融合以及表达相应蛋白等促进肿瘤的发生发展，但其在DLBCL上介导细胞间通讯的具体机制尚不清楚。

1.2.2外泌体重编辑骨髓 骨髓造血微环境是血液系统恶性肿瘤发病机制的重要因素之一，肿瘤细胞可利用外泌体作为生长因子、细胞因子、酶、血管生成分子和遗传物质的载体来重新改造骨髓微环境，以促进血液系统恶性肿瘤的发生。Peinado等[10]首次证实，TEX可作为破坏造血干细胞以及正常细胞造血功能的新的生物因子，而黑色素瘤衍生的外泌体可通过介导MET癌蛋白的转移“指引”骨髓造血干细胞支持黑色素瘤的生长和转移。Kumar等[11]的研究表明，急性髓系白血病源性外泌体通过上调DKK1(一种正常造血和成骨的抑制剂)将骨髓培养成适合白血病细胞生长和抑制正常造血的微环境。骨髓间充质干细胞可以接收成人T细胞白血病/淋巴瘤源性外泌体的相关基因，激活核因子κB通路，从而造成白血病细胞增殖、迁移和血管生成。此外，慢性髓系白血病患者外周血还可释放双调蛋白的外泌体，并通过其激活表面生长因子受体进而重编辑骨髓，导致慢性髓系白血病的发生。因此，外泌体通过其产生的基质直接或间接地抑制骨髓微环境、重新编辑骨髓微环境，进而抑制正常造血功能，并为肿瘤细胞提供生长、增殖、转移的有利环境。

1.2.3外泌体参与免疫逃逸 肿瘤患者体内的肿瘤细胞需要经历各种转化，以躲避机体的免疫监测。由于TEX中含有肿瘤特异性抗原等物质，能够参与肿瘤细胞的免疫逃逸[12]，外泌体在免疫系统中发挥信号作用，可将未成熟树突状细胞上的主要组织相容性复合体分子转移到其他树突状细胞，从而激活免疫反应。TEX介导免疫抑制可通过结合受体细胞膜表面分子激活或抑制相关蛋白受体发出信号并启动下游通路。TEX上有较多自然杀伤细胞活化型受体NKG2D的配体，故可通过降低自然杀伤细胞活化型受体NKG2D的数量影响自然杀伤细胞、自然杀伤T细胞和细胞毒性T细胞的功能[13]。TEX还可以导致T细胞功能受损，使受外泌体影响的T细胞在肿瘤抗原的持续刺激下上调程序性细胞死亡受体-1、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4和B/T淋巴细胞弱化因子，并激活Fas/FasL途径诱导T细胞凋亡，引起DLBCL[14]。外泌体表面的PD-L1与肿瘤进展有关，携带免疫抑制蛋白PD-L1的TEX，可使免疫细胞丧失活性，使其不能识别和杀伤肿瘤细胞。此外，致癌病毒也可以利用外泌体调节细胞微环境，逃避免疫系统的识别并加速肿瘤进展，从而使病毒诱导的淋巴细胞瘤复杂化[15-16]。免疫监控是人体避免肿瘤发生的关键调控机制，目前外泌体可通过自身特性调节自身囊泡表面所分泌的物质，使肿瘤细胞逃避人体正常的免疫监控及免疫清除机制，这有助于寻找免疫逃逸过程的关键点，针对其研发出特定的靶向药物，以避免肿瘤的进一步发展。

1.2.4外泌体参与重塑微环境 微环境是生物体细胞生存的基本环境，其稳态是维持细胞正常生长、增殖、分化和代谢的正常条件，微环境的重塑是肿瘤发生发展的一个关键因素。淋巴瘤源性外泌体含有参与抗原呈递的蛋白质，肿瘤细胞可将外泌体作为细胞因子、血管生成因子和遗传物质等载体重塑肿瘤微环境。外泌体与靶细胞质膜融合后，以不同方式促进功能和表型改变，重塑适应疾病进展的微环境。骨髓间充质干细胞内吞淋巴瘤外泌体后，产生CC趋化因子受体2招募大量巨噬细胞，进而促进淋巴瘤的生长[17]。MYD88突变的淋巴瘤B细胞衍生的外泌体能够触发肥大细胞和巨噬细胞中促炎信号的激活，将肿瘤微环境重新编程为肿瘤促进子，改变微环境导致肿瘤发生。在EB病毒阳性DLBCL中，TEX携带的EB病毒来源的非编码RNA能够被单核巨噬细胞吞噬，促进肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-10、Arg1基因的表达，导致巨噬细胞变化，淋巴增生性疾病的加重[18]。同时，肿瘤可通过其所分泌的外泌体改变其自身代谢，使其重编程，并向肿瘤细胞提供存活所需的物质，以促进肿瘤细胞生长。TEX通过抑制抗肿瘤免疫反应，或通过促进肿瘤转移过程中血管生成或肿瘤向身体其他部位的迁移促进肿瘤生长。综上，外泌体可通过释放、诱导产生与DLBCL相关的炎症介质等细胞因子促进间充质干细胞增殖，进而促进DLBCL进展。

1.2.5外泌体抵抗化疗药物 在接受一系列治疗后，DLBCL患者短期内进入复发/难治阶段，这在很大程度上源于肿瘤对化疗药物的耐药。研究表明，DLBCL来源外泌体可通过转移多药耐药蛋白和微RNA(microRNA，miRNA/miR)、输出杀肿瘤药物及中和抗体药物来影响耐药性，在前列腺癌治疗上，外泌体可诱导肿瘤对多西他赛等化疗药物产生耐药，导致肿瘤进展[19-20]。在Qin等[21]的研究中，顺铂耐药的肺癌细胞释放的外泌体，通过下调miR-1005p诱导受体细胞耐药，进而增加哺乳动物雷帕霉素靶蛋白表达，表明外泌体可通过调节细胞因子等诱导肿瘤对化学药物的耐受性。一项关于B细胞淋巴瘤的研究表明，外泌体可能参与细胞中阿霉素和像素酮的输出，且吲哚美辛对ATP结合盒转运体A3的消耗抑制了外泌体的生物发生，并增强了药物的核捕获，增加了其对DLBCL细胞系的细胞抑制功效，提示可通过靶向外源性生物合成来克服化疗耐药性并提高药物疗效[22]。TEX使癌细胞能够调节自身周围环境，其携带生存和增殖信号分子，协助肿瘤免疫逃避并获得耐药性，外泌体介导药物外排减少并减缓抗癌药物的渗透，进而影响疾病的发生发展。由此可见，在DLBCL治疗上，可通过减少外泌体释放降低肿瘤对化疗药物的抗性，尽可能发挥化疗药物的疗效，以延长DLBCL患者的无进展生存期，并提高治疗的总有效率。

2 外泌体在DLBCL中的应用

2.1DLBCL生物标志物 外泌体被认为是“液体活组织检查”的成熟形式，富含各种生物流体，可实现肿瘤的无创性早期诊断、预后及治疗反应评估。外泌体miRNA和蛋白质是一种有效方法[23]。有证据表明，外泌体可作为血液系统肿瘤的监测指标[24]。R/R DLBCL患者、对化疗药物有良好反应性患者、健康成人之间的外周血外泌体含量有显著差异[25]。Zare等[26]的研究发现，外泌体miR-155、let-7g和let-7i可能作为评估接受标准化疗DLBCL患者治疗反应的潜在预后指标。Higuchi等[18]的研究认为，BamHI片段miRNA或可成为EB病毒阳性DLBCL的一种诊断标志物，含有BamHI片段miRNA的外泌体可能成为一种有前途的诊断工具和B细胞淋巴瘤治疗的新靶点。一项研究报道，包括血浆囊泡在内的miRNA水平可反映单个经典型霍奇金淋巴瘤患者的存在、治疗反应和复发[27]。Hong等[28]报道，与健康对照组相比，确诊且未治疗急性髓系白血病患者血浆中衍生的外泌体蛋白质和转化生长因子-β1水平显著增高，并在诱导治疗后下降，巩固治疗期间有所上升，患者达到长期缓解后恢复正常。Peng等[29]发现，急性髓系白血病患者的治疗反应和预后与外泌体表达的miR-34c-5p水平显著相关。Allenson等[30]证实，血浆外泌体DNA可用于早期检测恶性肿瘤患者的特异性突变。可见，外周血以及患者肿瘤组织中的外泌体均可能成为预测患者疾病进展、评估药物疗效及患者生存的生物标志物，但其临床应用还有待深入探索。

2.2DLBCL靶向药物新载体 在循环稳定性、免疫逃逸、毒性等方面，外泌体较其他合成药物递送载体(如脂质体、合成纳米颗粒和重组病毒载体)更适用于药物递送。外泌体的“天然”特征使其成为囊泡传递载体的理想替代品:①外泌体的微小体积有助其在细胞间转移；②外泌体结构和组成保护分子免受核酸酶和蛋白酶的作用；③外泌体的免疫原性和毒性相对较低；④特定表面蛋白质和脂质的存在使循环中的外泌体趋于稳定，并使其细胞和组织特异性具有趋向性[31]。外泌体能够将“货物”运送到其他细胞，并可改变靶细胞的基因表达、信号传递等功能；外泌体能够装载特异物质，并成为细胞间遗传物质交换和通讯的载体。通过外泌体转运的核糖核酸物种可转录成互补DNA或在受体细胞内翻译。将外泌体作为载体的药物可以提高特定“货物”治疗疾病的靶向性，如装载多柔比星的外泌体用于抑制乳腺癌和结肠癌的生长，效果较为显著。外泌体的存在可能为DLBCL患者提供一种新的治疗方案，且外泌体作为药物载体的给药方式多样，可静脉注射、直接注射于瘤体内、鼻腔给药，有利于药物的临床应用。新的药物载体应较现有药物载体具有更强的靶向性，由于外泌体的天然靶向性不强，需要通过基因工程等修饰作用增强外泌体的靶向性，以使外泌体成为新一代靶向药物。

2.3DLBCL免疫治疗新方法 肿瘤免疫治疗依赖于人体自身免疫系统的功能，是一种理想的治疗方式，不良反应小。肿瘤来源的外泌体含有内源性肿瘤抗原，它们与免疫系统相互作用，可为开发新的免疫治疗策略提供帮助。基于此，外泌体的抗肿瘤免疫作用已用于抗癌疫苗的研发。同时，外泌体也是一种有价值的免疫治疗剂，在肿瘤免疫治疗的临床前研究中有重要意义，由于B细胞和树突状细胞源性的外泌体负载肽或全蛋白抗原，具有诱导抗原特异性T细胞和B细胞反应的能力。Chen等[32]的研究评估了热休克小鼠B淋巴瘤细胞源性的外泌体在诱导抗肿瘤免疫反应中的功效，证明HS-Exo可通过激活T细胞和树突状细胞诱导强抗肿瘤免疫应答。此外，通过激活肿瘤特异性CD4+和CD8+的γ干扰素细胞，从携带T细胞淋巴瘤的小鼠腹水中分离的外泌体能表达CD24和热激蛋白90诱导肿瘤特异性体液和细胞免疫应答[33]。外泌体免疫的T细胞显示出特异性的抗淋巴瘤细胞特点。传统的免疫治疗往往基于肿瘤组织进行，而DLBCL患者肿瘤组织取材相对困难，且局部取材可能存在肿瘤异质性，但基于外泌体而产生的免疫治疗的取材可极大程度上避免局部取材异质性，因此外泌体有望成为一种新的免疫治疗标志物。随着对外泌体研究的不断深入，针对淋巴瘤来源的相关抗原免疫治疗具有可观前景，且外泌体来源的免疫治疗“新生物”具有潜在优势。

3 展 望

在液体活组织检查时代，TEX在DLBCL的诊断和治疗等方面有巨大的应用前景。在淋巴瘤病程进展中，DLBCL源性外泌体通过改变肿瘤微环境、拮抗化疗药物、重编辑骨髓等方式影响DLBCL的进程及患者预后，并可作为淋巴瘤患者的生物标志物，预测疾病发展变化趋势。目前，对外泌体的相关研究较多，但对其运载药物、靶向治疗以及相关机制的研究较少。此外，由于缺乏标准化的分离和定量方法，外泌体的临床应用尚未充分开发。未来，可致力于外泌体及其相关蛋白、miRNA等在免疫治疗方面的研究。