DNA甲基化与肺癌三级预防及预后的研究进展

温松，李慎柯，姜东亮

(1.新乡医学院，河南 新乡453003； 2.濮阳市油田总医院呼吸内科，河南 濮阳 457001)

肺癌是导致人类癌症死亡的最常见原因之一[1]。国家癌症中心数据显示：2015年我国恶性肿瘤发病约392.9万人，死亡约233.8万人，其中肺癌是我国恶性肿瘤发病及死亡的首要因素[2]。扼制我国肺癌持续上升的发病率及死亡率，是减轻癌症负担的关键，而提升肺癌的三级预防水平是有效降低肺癌发病率及死亡率的重要手段。癌症的发生发展是由遗传、表观遗传、环境等因素相互作用的多步骤、异常累积的结果。1942年Waddington首次确立表观遗传学的概念[3]，而随着研究的深入，现代医学认为表观遗传学是指在基因DNA序列不变的情况下能与基因相互作用且在有丝分裂中可遗传的变化[4]。表观遗传主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑、调控RNA等表观遗传修饰，其中DNA甲基化则是基因表达调控最主要、最常见且最具有特征性的表观遗传修饰方式[5]。目前大量研究已证实DNA甲基化模式与肺组织癌变及肺癌细胞的侵袭、转移密切相关[6]。现就DNA甲基化与肺癌三级预防及预后的研究进展进行综述，以期为肺癌的防治策略提供参考。

1 DNA甲基化

人类基因组中普遍存在DNA甲基化现象，且DNA正常的甲基化状态对机体细胞正常的结构和功能至关重要[7]。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下，将甲基(多以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体)与基因组CpG二核苷酸胞嘧啶的第五位碳原子共价结合的表观遗传修饰[8]。人类的基因组中CpG存在两种普遍状态：一种是无规律的散落于全DNA链；另一种则多位于各基因的顺式作用元件，呈高度聚集状态。这种高度聚集的CpG链称为CpG岛，CpG岛外的CpG 70%～80%是甲基化的，而CpG岛内绝大多数是非甲基化状态，这种DNA甲基化模式使各基因的表达调控精确有序。人们通过分析体内外细胞DNA甲基化发现，DNA的高甲基化状态表明基因表达的抑制/沉默/失活，而低甲基化表明基因表达的活跃/活化/激活[9-11]。DNA甲基化不仅参与正常哺乳动物的生长发育，还在癌症形成过程中起重要作用。有研究证实肿瘤的发生发展与DNA异常的甲基化密切相关，在肿瘤细胞中DNA的异常甲基化具体表现为全基因组水平的低甲基化及顺式作用元件内启动子等处CpG岛的普遍高甲基化状态[12-14]。肿瘤细胞基因组的这种甲基化现象致使肿瘤细胞的基因及染色体稳定性降低，全基因组原癌基因普遍活化，抑癌基因、DNA修复基因表达受抑制或失活。进一步研究发现细胞恶性程度越高，细胞全基因组的低甲基化程度愈显著[15-16]。现有的研究表明肺部细胞基因组异常的甲基化模式可主动或被动地促进肺癌的发生发展[4-6]，但目前DNA异常甲基化与肺癌的确切关系尚无广泛共识，DNA的异常甲基化可能是肺癌形成的一种诱因，也可能是肺组织细胞癌变的主要原因或肺组织细胞癌变中的某一环节，仍需进一步研究。

2 DNA甲基化与肺癌的一级预防

当肺部组织细胞暴露于吸烟、颗粒物、石棉、药物或慢性炎症等危险因素，常发生包括DNA异常甲基化在内的异常表观遗传修饰[17-18]。

从1991年至今，美国癌症总死亡率下降29%，减少了约290万癌症死亡人数，这一良好的成果主要归功于吸烟人群的减少[19]。吸烟是我国癌症总负担的主要构成因素，研究显示吸烟者和从未吸烟者体内肿瘤的发生发展是由不同的分子和表观遗传机制驱动[20]，如Baglietto等[21]将吸烟者与非吸烟者进行对比研究，发现仅吸烟者中的半乳糖凝集素-4基因有显著的高甲基化和表达下调；Tam等[22]研究表明细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(cyclin dependent kinase inhibitor 2A，CDKN2A)基因的高甲基化与吸烟量和吸烟时间呈正相关，与戒烟时间呈负相关，且在非吸烟者的肺部组织中CDKN2A基因并未出现高甲基化。另有研究表明，吸烟者体内F2R样凝血酶/胰蛋白酶受体3、芳香烃受体、脆性组氨酸三联体、CDKN2A、芳香烃受体抑制因子、miR-487b、DPH6(diphthamine biosynthesis 6)和胰岛素样生长因子Ⅱ信使RNA结合蛋白3基因的异常甲基化均与肺癌风险相关，其中DPH6和胰岛素样生长因子Ⅱ信使RNA结合蛋白3基因的异常甲基化与非小细胞肺癌显著相关[23]。Stidley等[24]研究发现，多种维生素、叶酸和绿色蔬菜可预防吸烟人群气道组织细胞基因启动子的异常甲基化，降低肺癌的发病率。

流行病学研究表明，空气污染特别是颗粒物质暴露，是独立于吸烟外与肺癌发生和死亡相关的危险因素[25]。Tantoh等[26]通过对比具有PM2.5差异的中国台湾北部和中部/南部地区的非吸烟成年人的SRY盒转录因子2(SRY-box transcription factor 2,SOX2)基因启动子甲基化状况发现，SOX2启动子甲基化状态可作为工业空气污染暴露的潜在生物标志物。此外，SOX2启动子的甲基化程度可能反映癌症发生的倾向，从而可以早期筛查健康非吸烟者是否处于癌前病变阶段。

不同于空气污染，尽管吸烟相关的CpG和石棉暴露状态相关的CpG平均甲基化率不同，但这两种暴露方式的基因组DNA甲基化谱可能有重叠，表明职业暴露(石棉)与吸烟在肺癌风险方面的相互作用介于相加性与倍增性之间。Kettunen等[27]研究发现肺癌组织中骨形成蛋白4、G蛋白偶联受体135、ZSCAN31(zinc finger and SCAN domain containing 31)、细胞黏附分子和信号受体、硝酸盐调控基因2、甲状腺过氧化物酶和瞬时受体电位阳离子通道3甲基化的变化与患者癌前的石棉暴露梯度有关，表明石棉暴露可能与肺癌相关。另外，铬及其化合物在焊接、电镀、颜料、合金制造等化工行业被广泛应用，研究表明铬酸盐暴露可引起肺癌错配修复基因错配修复基因1的DNA甲基化累积[28]。

综上所述，某些基因或基因启动子的异常甲基化可作为肺癌风险的预测因素及肺癌癌前病变的预测指标，将DNA甲基化的监测运用于肺癌一级预防，可为肺癌的一级预防提供表观遗传学的理论依据，从而降低我国肺癌发生率，改变肺癌防治“重治轻防”的现状，促进肺癌一级预防工作的实施。

3 DNA甲基化与肺癌的二级预防

目前临床确诊的局限期肺癌的5年生存率为57%[19]，转移性肺癌的5年相对生存率为5%，而大部分患者(57%)在诊断时已经处于疾病晚期[29]。临床上主要通过CT和血清肿瘤标志物相结合的方法进行肺癌诊断。CT筛查早期肺癌易出现假阳性结果，而临床开展的肺癌相关血清肿瘤标志物检测的敏感性及特异性有待提高。即使两者联合也无法达到早期发现、精准诊断的目的。

随着分子诊断技术的不断革新，通过检测DNA异常甲基化，特别是基因启动子内CpG岛的高甲基化检测成为目前肿瘤诊断检测研究的热点。相较于DNA低甲基化，高甲基化异常往往较先出现，具有更高的敏感性[4]。与细胞周期调控有关的Ras相关区域家族1A(Ras association domain family member 1A,RASSF1A)、CDKN2A，与转录相关的腺瘤性结肠息肉病基因、矮小同源盒基因(short stature homeobox 2,SHOX2)，与细胞凋亡相关的死亡相关蛋白激酶及与DNA修复相关的O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶均是研究相对较多的高甲基化位点。有研究表明，支气管抽吸物内SHOX2的DNA甲基化状态可用于肺癌的早期诊断[30]。Kneip等[31]在400多个血浆样本中研究了SHOX2甲基化与肺癌早期诊断的关系，发现其具有较高的灵敏度(60%)和特异度(90%)。基于上述研究，2012年生物标志物SHOX2甲基化开始应用于临床。有研究发现，联合检测肺泡灌洗液中SHOX2与RASSF1A的甲基化状态诊断肺癌的灵敏度为71.5%～83.2%，特异度为90.0%～97.4%[32]。Hulbert等[33]通过甲基化特异性聚合酶链反应检测早期肺癌患者痰液中速激肽前体1、SOX17和同源盒A簇17基因启动子甲基化状态，对肺癌早期诊断的特异度为98%。Liang等[34]以循环肿瘤DNA作为DNA甲基化的检测样本，开发了一种高度敏感的非侵入式诊断检测方法，可以区分肺癌与良性肺结节，在实验阶段实现了对肺癌的早期诊断。

综上，某些特定基因的异常甲基化特异性高，且多发生于癌前病变或(和)癌变早期，是肿瘤早期诊断较为理想的潜在标志物，通过对其实验研究有望形成成熟的无创性肺癌早期诊断技术，提高肺癌早期诊断率，达到早发现、早诊治的目的，对于肺癌的二级预防具有重要意义。

4 DNA甲基化与肺癌的三级预防

DNA甲基化可以通过被动和主动的方式去除，表明DNA的表观遗传修饰是一种动态可逆的过程[35]，这为从DNA甲基化着手治疗肺癌提供了理论上的可能性。但是DNA甲基转移酶抑制剂在单药治疗肺癌的临床试验测试中仅显示出低活性和低毒性[8]。早期探讨的DNA甲基转移酶抑制剂与化疗或与其他靶向治疗结合的疗效研究绝大部分无实质性进展[36-37]。一项关于DNA甲基转移酶抑制剂(SGI-110)和组蛋白去乙酰化酶抑制剂恩替诺特联合治疗肺癌的研究发现，该方案可减轻肺癌的肿瘤负荷，并对表观基因组进行重新编程[38]。而Shieh等[39]研究发现，TMU-35435和5-氮杂-2′-脱氧胞苷在体内外可通过对抑癌基因和Wnt信号通路负调控基因的再激活，达到协同抗肿瘤作用且无明显不良反应。Niu等[40]通过甲基化敏感酶切计数测序法对全基因组DNA甲基化进行分析，筛选出60个异常甲基化基因并进行相关验证，揭示了γ氨基丁酸B2受体是表皮生长因子受体19缺失性肺腺癌诱导治疗的新表观遗传学靶点。

此外，DNA甲基化不仅可以作为肺癌的治疗靶点，还有助于选择与评估治疗药物和手段。例如，T-BOX转录因子2亚家族的甲基化状态可以作为非小细胞肺癌对抗肿瘤药物5氮杂胞苷反应的预测指标[41]；轴抑制蛋白基因甲基化状态可能是预测肿瘤放射敏感性的重要因素之一[42]；非小细胞肺癌细胞的miR-9启动子甲基化状态可反映非小细胞肺癌的放射敏感性[43]。Grasse等[44]研究发现通过评价低密度脂蛋白受体相关蛋白12 DNA甲基化状态可以预测肺癌对卡铂的耐药状况。而Zhang等[45]的研究则发现去甲基化药物阿扎胞苷与组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A的小剂量联合应用可逆转顺铂耐药。抗程序性细胞死亡受体1/程序性细胞死亡配体1单抗是非小细胞肺癌治疗的一个重大突破，而DNA甲基化异常是肿瘤对宿主免疫活性反应的重要决定因素[46]。通过测试甲基化抑制剂是否能减少全基因组低甲基化的肿瘤中CpG岛的高甲基化状态或松动异染色质结构以恢复α/β干扰素反应和其他免疫调节途径，可以决定是否将表观遗传疗法与免疫疗法相结合，以进一步提升抗程序性细胞死亡受体1/程序性细胞死亡配体1单抗药物对肺癌的疗效[47]。目前最先进的表观遗传学生物标志物是O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶的甲基化状态，可以预测胶质瘤对替莫唑胺和卡莫司汀的反应，并已在临床上成功运用[16]，但在肺癌中尚未见报道。

综上，特定基因的甲基化有望作为肺癌治疗的生物靶点，对肺癌的治疗药物及治疗方案进行选择评估，改善患者的5年生存率。同时，针对肺癌患者DNA异常甲基化的治疗方式也将改变肺癌治疗的现有模式。DNA甲基化过程的动态可逆为从DNA甲基化入手治疗肺癌提供理论上的可能性。

5 DNA甲基化与肺癌的预后

肺癌患者的不良预后与诸多基因的异常甲基化状态密切相关，这些基因作用于肺癌发生发展的各个方面，包括信息传递[跨膜蛋白(transmembrane protein,TMEM)196、TMEM88、轴抑制蛋白、腺瘤性结肠息肉病基因]，DNA修复(人类错配修复基因1、O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶)，细胞凋亡[死亡相关蛋白激酶、PCED1B(PC-esterase domain containing 1B)、RASSF1A]，细胞分化(SOX2、Tet甲基胞嘧啶双加氧酶、同源盒A9)，细胞分裂(CDKN2A)，细胞转移及侵袭(转化生长因子-β诱导基因、组织蛋白酶抑制剂3、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-5、上皮钙黏素、肺癌食管癌缺失基因1、Runt相关转录因子3、F2R样凝血酶/胰蛋白酶受体3、跨膜丝氨酸蛋白酶4、Egl 9同源物2、黏蛋白4)等。进一步研究发现，不同基因的甲基化状态可以揭示相同组织学类型肺癌患者的预后，而相同基因的甲基化状态也可以评价多种类型肺癌患者的预后[48]。例如，转化生长因子-β诱导基因启动子的甲基化状态、RASSF1A启动子的甲基化状态、同源域蛋白同源盒基因的甲基化状态均是肺腺癌患者的独立预后指标[49-51]；TMEM196的甲基化状态则是肺腺癌与肺鳞状细胞癌患者共同的独立预后指标[52]；跨膜丝氨酸蛋白酶4启动子的低甲基化状态是早期鳞状细胞肺癌患者的独立预后指标[53]；TMEM88启动子的高甲基化、长散在核重复序列1低甲基化是早期非小细胞肺癌患者的独立预后指标[16,54]；Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1的甲基化状态则与绝大多数肺癌的预后相关[55]。

肺癌患者的预后与基因甲基化作用相对应的DNA甲基转移酶的改变密切相关。Lin等[56]研究发现DNA甲基转移酶1过表达可引起多个抑癌基因的遗传改变，而这些抑癌基因的遗传改变与肺部肿瘤的发生及其不良预后密切相关。Teneng等[57]的研究则表明DNA甲基转移酶3b过表达可加速致癌物质在细胞系中的转化，并与肺癌患者的不良预后相关。

甲基化评分是预测肺癌患者预后的指标。Jeschke等[58]研究表明肿瘤浸润淋巴细胞的甲基化评分独立于肺鳞状细胞癌患者的其他预后变量，可以预测不同甲基化评分患者的存活率。而Liu等[59]的研究表明基因组的低甲基化评分是影响肺癌患者总生存期的独立因素。

综上，DNA甲基化与肺癌患者的预后密切相关，某些特定基因的甲基化是肺癌患者可靠的预后指标，可以揭示及预测肺癌患者复发转移的可能性，指导患者的临床治疗，从而延长肺癌患者的总生存期，具有重要的临床价值。

6 展 望

随着探索的深入，人们对甲基化与肺癌相关性的认识越发完善，但DNA甲基化与肺癌三级预防及预后的研究仍存在有待解决的问题：①DNA甲基化与肺癌治疗的研究多集中于DNA甲基转移酶抑制剂药物方向，而肺癌的抗低甲基化药物以及甲基化双向调节药物相关研究较少[60]；②现有的DNA甲基化与肺癌患者预后的研究多为小样本单中心研究，缺乏综合性涵盖所有肺癌类型的大样本多位点研究，尚未形成系统的预后评价标准；③虽然DNA甲基化测序技术不断改进，DNA甲基化的检测样本来源从组织细胞、肺泡灌洗液、痰液、血液发展到呼出气冷凝液，但各种检测样本和检测技术均有各自的优劣，暂无系统的标准化检测方案；④肺癌与DNA甲基化的研究多处于理论研究阶段，将DNA甲基化落实到肺癌三级预防及预后的各个方面还需要进行大量的实验研究及临床论证。总之，DNA甲基化与肺癌三级预防及预后的研究尚处于起步阶段，但也不能忽视DNA甲基化在肺癌三级预防及预后方面的重要研究价值及良好的应用前景。