CapG作为膀胱癌潜在生物标志物的研究进展

车禹男，南锡浩，马瑞，于欣洋，郭振海

(牡丹江医学院附属红旗医院a.泌尿外科，b.神经内科，黑龙江 牡丹江 157011)

膀胱癌是男性第四大常见癌症，居泌尿系统肿瘤发病率、致死率的第一位，是全世界癌症相关死亡的重要原因之一[1]。其中以膀胱尿路上皮癌最常见，约占90%。采用经尿道膀胱肿瘤电切术治疗浅表或非肌层浸润性膀胱癌往往存在肿瘤复发或进展的可能[2]。肌层浸润性膀胱尿路上皮癌常合并远处转移，可行根治性膀胱切除术+放化疗，但死亡率高[3]。由于临床缺乏膀胱癌合适的诊断性生物标志物和有效治疗方法，患者确诊时往往已为疾病晚期，故病死率不断升高[4]，因此从遗传学角度研究膀胱癌的靶向药物尤为重要。近年研究发现，多种肿瘤(如乳腺癌[5]、神经胶质瘤[6]、前列腺癌[7]、结直肠癌[8]和胃癌[9])组织中均有巨噬细胞加帽蛋白(gelsolin-like actin-capping protein，CapG)表达，且随着肿瘤分期、分级的增加，CapG基因表达水平也不断升高，表明CapG在肿瘤的增殖、侵袭和转移过程中起促进作用，证实CapG高表达是肿瘤患者不良预后的独立预测因素。癌症基因组图谱(the cancer genome atlas，TCGA)[10]中的数据表明，CapG在大多数癌症中的表达频繁上调，尤其在膀胱尿路上皮癌中，但目前有关CapG在膀胱癌的研究报道较少见，且其在膀胱癌中表达情况、临床意义和预后价值尚不完全清楚。现对CapG作为膀胱癌潜在生物标志物的研究进展予以综述。

1 CapG的概述

凝溶胶蛋白[11]超家族是一个进化保守的蛋白质家族，广泛存在于真核细胞生物之间，包括凝溶胶蛋白、绒毛蛋白、肌切蛋白、CapG、近绒毛蛋白、超绒毛蛋白、类绒毛蛋白和FliⅠ (Flightless-Ⅰ)八种蛋白，上述蛋白包含3或6个凝溶胶蛋白样结构域的同源重复序列，均属于肌动蛋白结合蛋白，大部分成员能够切断肌动蛋白丝并降低其交联成凝胶网络的能力，可将细胞质巨噬细胞提取物从凝胶相转变为溶胶相[12]。研究发现，CapG广泛参与细胞信号转导、吞噬作用、囊泡运动、细胞运动等生物学活动[13]。CapG最初在兔的肺泡巨噬细胞中发现[14]。在凝溶胶蛋白家族中，CapG是唯一可以定位表达于细胞质和细胞核的肌动蛋白结合蛋白，且只有3个凝溶胶蛋白样结构域的成员，这是其区别于其他家族成员的独特特性[15-17]。人类的CapG基因定位于2p11.2，基因全长19.33 kb，由13个外显子和12个内含子组成，信使RNA全长1 314 bp，含有348个氨基酸，蛋白分子量约为38 000[18]。

2 CapG的生物学功能

2.1参与肌动蛋白的调节 研究表明，磷脂酰肌醇二磷酸[phosphatidylionositol(4，5)bisphosphate，PIP2]能抑制CapG的加帽活性，阻止CapG与纤丝状肌动蛋白(filamentous actin，F-actin)聚合体倒刺末端结合[19]。Fu等[19]通过互补DNA克隆鉴定和蛋白质纯化发现，CapG39与凝溶胶蛋白序列有49%的同一性。随后的肌动蛋白解聚实验证实，CapG39与凝溶胶蛋白均通过与F-actin倒刺末端不断结合而逐渐封盖其倒刺末端，最终形成帽状结构[20]。CapG39以加帽方式控制肌动蛋白的聚合反应，达到调节肌动蛋白长度的目的，但CapG39并不会切断F-actin[21-23]。

CapG与肌动蛋白的结合能力受到Ca2+和PIP2的调控，其中Ca2+浓度对CapG与肌动蛋白结合能力的调控可逆，当细胞质中游离Ca2+浓度升高时，CapG与F-actin倒刺末端的加帽速度加快；Ca2+浓度低于1 mol/L时，CapG迅速从F-actin倒刺末端解离。高浓度Ca2+可直接加快F-actin的加帽速度，进而阻碍肌动蛋白的聚合反应，最终影响肌动蛋白细胞骨架的重排[24]。

2.2参与巨噬细胞中受体介导的起皱作用、吞噬作用 起皱作用由肌动蛋白丝局部聚合组装引起[25]，往往巨噬细胞的起皱速度与细胞质内Ca2+浓度的瞬时上升和下降有关，表明该过程对Ca2+浓度变化敏感。CapG是唯一可逆的Ca2+敏感的加帽蛋白，其在调节巨噬细胞受体介导的起皱作用中起关键作用。Witke等[26]观察敲除CapG小鼠的骨髓巨噬细胞运动性发现，与野生型巨噬细胞相比，敲除CapG巨噬细胞的自发和集落刺激因子诱导的起皱活动几乎完全丧失，在确认CapG引起起皱活动降低后，通过显微注射重新注入CapG蛋白30 min后，集落刺激因子诱导的起皱活动显著增加。

除了起皱之外，巨噬细胞还能快速形成假足，以摄取和消灭外来颗粒。CapG在巨噬细胞中大量存在，可能是巨噬细胞发挥吞噬作用的主要功能成分，Witke等[26]的实验发现，与野生型巨噬细胞相比，CapG-巨噬细胞免疫球蛋白G补体和未调理的酵母聚糖颗粒吞噬作用减少约50%，表明CapG是巨噬细胞发挥吞噬作用的主要功能成分，并间接证明其他肌动蛋白结合蛋白也参与了此过程，但具体肌动蛋白结合蛋白的类型有待进一步研究。综上，CapG参与巨噬细胞的起皱与吞噬作用可能在宿主防御和免疫反应中发挥关键作用，有望成为炎症调节的靶标。

2.3参与真核细胞有丝分裂 在细胞分裂过程中，存在肌动蛋白和微管细胞骨架之间的交叉串扰。有丝分裂纺锤体介导的肌动球蛋白收缩环的调节和F-actin介导的中心体在有丝分裂前的运输代表了肌动蛋白细胞骨架和微管依赖的细胞器之间的相互作用。CapG是凝溶胶蛋白家族中唯一可以定位于细胞质和细胞核中的蛋白[15]，通过转运受体RNA GTPase、NTF2和核孔蛋白Nup62[27-28]进入细胞核。在细胞核中，CapG被主动转运到转录活性核仁[29]。

Hubert等[30]提出，CapG可能作为肌动蛋白细胞骨架和微管细胞器之间调节细胞分裂的串扰媒介。鉴于以上假设研究CapG在有丝分裂过程中的细胞定位，通过免疫荧光显微镜检查发现，内源性CapG和增强型绿色荧光蛋白标记的CapG定位于间期中心体、有丝分裂中的纺锤体和脱落的中体环，提示CapG在肌动蛋白细胞骨架和微管为基础的细胞器之间的交叉串扰中起中介作用，参与有丝分裂的调节过程。

2.4其他功能 CapG缺乏断裂活性，过表达可增加成纤维细胞的运动性，促进伤口愈合，同时也是内皮细胞运动功能的主要调节因子[23]。在肿瘤细胞中，CapG参与的细胞信号转导、吞噬作用、囊泡运动、细胞运动等生物学活动[13]常脱离了正常的调控，因此CapG被认为是潜在的肿瘤形成促进因素和抗肿瘤药物作用靶点[31]。

3 CapG与膀胱癌

3.1CapG与膀胱癌的发生发展 最常见的膀胱恶性肿瘤是膀胱尿路上皮癌，又称膀胱移行细胞癌(transitional cell carcinoma，TCC)。近年对TCC的全基因组和全外显子测序显示，p53蛋白、成纤维细胞生长因子受体3、结节性硬化症C1、磷脂酰肌醇-3-激酶催化亚单位α、视网膜母细胞瘤1和H-大鼠肉瘤基因存在反复突变，且姐妹染色单体的聚合、解离和染色质重塑中的遗传改变是TCC的主要标志[32-34]。CapG可调节肌动蛋白细胞骨架重组和成纤维细胞和内皮细胞的迁移[23]，在正常细胞中起重要作用，故推测CapG的失调可能导致尿路上皮细胞的恶变。对癌症基因组图谱的分析显示，CapG在不同病理分级膀胱癌中均有表达，且伴随病理分期、分级的升高，CapG的表达逐渐上调[35]。然而，CapG在膀胱癌中的具体作用机制尚不清楚，CapG作为肿瘤生物标志物的研究热点之一，可能是膀胱癌生物标志物。

3.1.1CapG的致瘤作用 酪氨酸激酶可诱导CapG表达上调，提示CapG表达可能与肿瘤进展有关[36]。另有研究表明，CapG通过胱天蛋白酶6/胱天蛋白酶9/B细胞淋巴瘤/白血病-2/磷酸化蛋白激酶B/蛋白激酶B信号通路影响细胞增殖和凋亡[37]。木海琦[18]通过体内外功能实验发现，CapG通过促进细胞周期、抑制细胞凋亡促进前列腺癌细胞体外增殖，证实CapG可促进裸鼠体内前列腺癌细胞的增殖。Zhaojie等[38]的实验研究显示，CapG在体内和体外均具有较强的致瘤能力。

3.1.2CapG的促迁移和侵袭作用 在多种肿瘤细胞中存在CapG表达，且在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用，相关基础实验证明，CapG对于肿瘤的侵袭和转移有促进作用，但具体机制尚不明确[39]。Chi等[5]在乳腺癌中发现，高CapG表达与乳腺癌预后不良相关，采用Western Blot检测稳定表达CapG的MCF-7细胞系，与空白对照组相比，MCF-7-CapG细胞的迁移和侵袭能力更强。伍威等[8]经免疫组织化学检测发现，CapG在结直肠癌组织的阳性表达明显高于癌旁正常组织，Transwell迁移实验显示，CapG对结直肠癌的细胞迁移起促进作用，提示CapG可能在人类结直肠癌的转移中发挥作用。Yun等[6]的伤口愈合和Transwell侵袭实验结果显示，CapG在胶质瘤迁移和侵袭中发挥着关键作用。Zhaojie等[38]通过伤口愈合和Transwell实验验证了CapG促进TCC的迁移和侵袭的能力，伤口愈合结果显示，与SW780-vec对照组相比，SW780-CapG组CapG基因表达增加了519%，迁移率提高了174%；CapG-组5637细胞的CapG表达较CapG+组5637细胞降低75%，迁移率明显降低；Transwell分析表明，SW780和5637细胞中CapG对细胞迁移和侵袭的促进作用相似，实验研究表明，CapG表达增加可以促进TCC的迁移和侵袭。综上所述，CapG可增强肿瘤细胞的侵袭和迁移能力，其可能成为肿瘤患者疾病进展及预后的实用判断指标，有助于相应治疗策略的选择。

3.1.3CapG介导的TCC发生和发展机制

3.1.3.1Hippo通路 Hippo通路是一种高度保守的发育途径，参与多种生物学活动，如控制器官大小、组织再生、干细胞自我更新、细胞分化、抑制细胞增殖并促进细胞凋亡、肿瘤的发生发展[40-41]。Hippo的主要成分包括哺乳动物不育系20样激酶1、大肿瘤抑制基因1(large tumor supressor gene 1，LATS1)、辅助激活因子：萨尔瓦多同源物1、MPS结合激酶激活剂1(MPS one binder kinase activator 1，MOB1)和下游核效应器Yes相关蛋白(Yes-associated protein，YAP)，其中YAP作为Hippo信号通路的核心成分，在细胞凋亡中具有双重作用。YAP与TEAD转录因子的结合可促进环加氧酶2[42]、凋亡抑制蛋白(Survivin)[43]、葡萄糖转运蛋白1[44]等抗凋亡基因的转录，同时也可启动凋亡基因的转录，如p53调节的凋亡诱导蛋白1[45]、重组蛋白DR5[46]、p53上调凋亡调控因子[47]。由于YAP具有上述特性，其可在多种癌症的发生和发展中发挥作用[48-49]，并可抑制多种肿瘤细胞的增殖[50]。Hippo通路的作用机制为哺乳动物不育系20样激酶1/2激酶与萨尔瓦多同源物1结合激活LATS1/2激酶[51]，从而激活与MOB1结合的LATS1/2，使YAP磷酸化，导致YAP在细胞质滞留，进而阻止YAP的核输入，导致其与转录因子的结合受到抑制。非磷酸化的YAP可以转位至细胞核，与TEA域转录因子结合，促进致癌基因的转录[52]。Zhaojie等[38]通过免疫荧光染色实验检测发现，SW780-CapG细胞质内YAP水平降低，细胞核内YAP水平升高，而CapG下调的5637细胞中，YAP的核定位显著下降，证实CapG在SW780细胞中过表达增加了MOB1、LATS1和YAP的去磷酸化，且CapG-5637细胞中MOB1、LATS1和YAP的磷酸化增加；为了进一步阐明Hippo通路在CapG调控肿瘤发生和转移中的关键作用，该研究还通过免疫荧光染色观察使用YAP抑制剂依托泊苷处理过的CapG过表达SW780细胞和空白对照组YAP的细胞定位发现，依托泊苷可降低YAP的核定位，导致细胞质中YAP增加，提示CapG导致的肿瘤发生和转移与TCC中Hippo通路有关，且CapG的过表达通过LATS1和MOB1去磷酸化导致肿瘤抑制途径Hippo失活，从而导致肿瘤的核转位。Hippo通路在CapG介导的TCC发生和发展中起重要作用，但CapG作用于Hippo通路的具体机制目前尚不清楚。

3.1.3.2磷脂酰肌醇信号通路 染色体重塑是TCC的主要标志之一，在Ca2+和PIP2调控下，CapG与肌动蛋白结合并调节细胞质和细胞核结构[14]。细胞核内的CapG参与PIP2驱动的染色质重塑[53-54]和转录调控[27]，最主要的是通过肌动蛋白的核化和组装[55]。因此，核肌动蛋白可能是控制染色质重塑的关键，故认为CapG介导的磷脂酰肌醇信号通路参与膀胱癌的发生发展。相关体外研究表明，磷酸肌醇的调节来源于BRG1/BRM相关因子(Brahma-related gene 1/BRM-associated factor，BAF)复合物的作用[56-57]。BAF复合物是调节T细胞发育所必需的前提条件，T细胞(抗原)受体(T cell receptor，TCR)调节细胞中的PIP2水平，并导致BAF复合物的核滞留；在体外，PIP2调节BAF复合物与染色质粗提取物的结合。哺乳动物BAF复合物在人类恶性肿瘤中最常见[58]。Aldiri等[59]的研究证明，BAF复合物可通过BRG1亚基与视网膜母细胞瘤抑制蛋白结合，同时肌动蛋白也可与BAF53结合，提示视网膜母细胞瘤在肿瘤中的抑制作用可通过BAF介导。Zhaojie等[38]对TCC的全基因组测序显示，视网膜母细胞瘤1存在基因突变。BAF复合物具备与肌动蛋白结合的亚基，还可与PIP2结合，同时CapG与肌动蛋白的结合受到PIP2的调节。BAF复合物与CapG在磷脂酰肌醇途径中有交汇点，目前两者相互作用的机制尚未阐明，但TCC中CapG的高表达说明TCC中PIP2含量的下降，因此与PIP2结合的BAF复合物减少，磷脂酰肌醇信号通路受到抑制，进而染色体重塑下降、信使RNA输出下降、抑制癌基因表达下降，最终导致TCC的发生，推测还需要大量基础实验研究的证明。

3.2CapG在膀胱癌中潜在的诊断和预后价值 癌症是世界范围内最主要的死亡原因之一，预后差[60]，作为全球主要的公共卫生问题，癌症的早期诊断和预后治疗尤为重要。有效的预后生物标志物可以更好地为临床决策提供诊疗思路和具体治疗方案[38]。CapG作为一种致癌基因，在胃癌、肝细胞癌、结直肠癌、肺癌、前列腺癌、胶质母细胞瘤和卵巢癌中均过表达，且其过表达与肿瘤的转移和侵袭有关。Yun等[6]研究发现，人脑胶质瘤组织中CapG的信使RNA和蛋白水平显著升高，对CapG过表达的U87和U251人脑胶质瘤细胞系以及CapG敲除的U87和U251人脑胶质瘤细胞系的细胞增殖实验显示，CapG过表达的U87和U251人脑胶质瘤细胞系增殖速度较快，而CapG敲除处理的U87和U251人脑胶质瘤细胞系停止增殖或增殖缓慢，表明CapG高表达可作为人脑胶质瘤预后不良的独立预后因素。Bahrami等[61]研究发现，CapG高表达与膀胱癌患者生存期呈负相关，CapG在癌旁正常组织以及膀胱癌组织中均表达，并在膀胱癌组织中呈过表达，故推断CapG过表达与膀胱癌的不良预后有关。CapG在真核细胞有丝分裂过程中具有重要作用，可影响DNA复制过程，并具有促进细胞增殖的作用，因此，CapG可能增强膀胱癌发生发展过程中癌细胞的侵袭力，促进癌细胞的转移，可能成为新的膀胱癌预后判断生物标志物。

4 小 结

CapG是一种多功能蛋白，参与介导细胞增殖、细胞分裂、细胞凋亡以及细胞吞噬等生物学活动。CapG是染色质重塑和转录调控中不可或缺的部分。在各种癌组织中，CapG的过表达或缺失可能影响疾病进程。CapG高表达与TCC细胞的迁移和侵袭能力呈正相关，提示CapG具有成为生物标志物和治疗靶点的潜能。目前，关于CapG在膀胱恶性肿瘤中作用的研究报道较少，随着研究的不断深入以及相关作用机制的逐渐清晰，可能在膀胱癌诊断和治疗中得到广泛应用。