微RNA参与调控肝纤维化的研究进展

李燚，陈睿，蒙增萍，申涌，陈瑜，刘咏梅

(1.贵州医科大学医学检验学院，贵阳 550025； 2.贵州医科大学附属医院 a.针灸推拿科，b.临床检验中心，贵阳 550004)

肝纤维化作为各种慢性肝损伤发展的终末阶段，已成为威胁全球人口健康的问题[1]。若未得到有效治疗，肝纤维化极有可能转变为肝硬化甚至肝细胞癌，如在肝纤维化早期阶段对肝损伤患者进行积极治疗，可使肝纤维化消退，逆转恶性后果，但目前尚未发现通用的特异性药物，仍只限于针对相应病因进行治疗[2]。酒精性及非酒精性肝病、自身免疫性肝炎、病毒性肝炎、药物和微生物诱发的慢性肝损伤均可导致肝脏病变，使肝脏发生纤维化[3]。肝纤维化以细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的过度累积和肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)的活化为特征[4]。正常生理条件下，HSC处于静息状态，其胞质内含有丰富的脂质颗粒，能够储存维生素A；肝脏受损后，HSC活化产生多种炎症因子及相关酶蛋白，参与肝脏的伤口愈合反应，同时静息HSC转化为肌成纤维细胞，在肝组织内产生过多胶原纤维、α-平滑肌肌动蛋白等ECM成分，ECM合成与降解的动态平衡被打破，肝组织结构紊乱发生重塑，逐渐发展为肝纤维化[4-6]。研究证明，多种外源性或内源性微RNA(microRNA，miRNA)可参与肝纤维化过程的调节[6-7]。现就miRNA在肝纤维化中的表达调控作用进行综述，为进一步寻找肝纤维化的治疗靶点提供新思路。

1 miRNA的合成及功能

miRNA主要由RNA聚合酶Ⅱ/Ⅲ(DROSHA、DICER)所转录，在真核生物胞核内，DROSHA、双链RNA结合蛋白、DiGeorge综合征关键区域8基因及相关蛋白组成微处理器复合体催化RNA生成约70 nt的茎环前体miRNA，即pre-miRNA；而后输出受体将其输入胞质，此时DICER酶对pre-miRNA进行再加工，生成miRNA双链体，解旋后其中一条链被降解，另一条链成为18～25 nt的成熟单链miRNA，与AGO蛋白结合形成RNA诱导的沉默复合体，随后与靶信使RNA(messenger RNA，mRNA)的3′非翻译区或5′非翻译区结合，在转录后水平抑制靶mRNA的转录或翻译，发挥生物学功能[8-11]。

miRNA有多种表达模式，一个miRNA可以靶向数百个mRNA，且一个mRNA可受数个miRNA的控制，它们共同形成调节网络，影响多个功能相关的基因表达[12]。miRNA可参与细胞的增殖、分化、迁移、衰老、死亡等过程，肝脏中的miRNA通过调控脂质代谢[13]、HSC的静默或活化[6]以及其他途径参与肝内代谢活动或疾病进程。研究证实，miRNAs与病毒相关的肝纤维化[14]、寄生虫性肝纤维化[15]、酒精性肝病[16]等肝脏疾病密切相关。

2 miRNA在肝纤维化中的表达

肝纤维化是一个涉及多病因、多信号的复杂肝脏损伤后的修复反应，也是一个动态的、可逆的病理生理过程，其基因表达调控的变化与miRNA的网络调节相关。肝损伤后循环中的特异miRNA可作为早期诊断肝纤维化的标志物，此外还可通过动态监测随肝脏疾病进展变化的miRNA监控疾病状态[17-18]。循环中的miRNA在细胞死亡过程中通过外泌体或微囊泡分泌运输，肝脏中各类肝细胞释放含有miRNA的外泌体或微囊泡后，被邻近细胞摄取或进入循环，传递调控信号；进入血液、尿液、脑脊液等体液中的miRNA因被包裹而较其他单独存在的miRNA更具稳定性[19-21]。

不同miRNA在肝纤维化的发展中起促进或抑制作用，表现为在肝组织、肝细胞、循环中的上调或下调，目前发现的在肝纤维化或其他肝病进展中上调的miRNA包括miR-122[22]、miR-221/222[23-24]、miR-192[25]、miR-16、miR-146、miR-571[26]、miR-34a[27]等，下调的miRNA包括miR-29a[28]、miR-30a[29]、miR-542、miR-652[26]等，有些miRNA(miR-29b、miR-155等)在不同情况下表现为抗纤维化或促纤维化的潜能，对肝纤维化进展具有双重作用。

3 miRNA在肝纤维化中的调控

不同miRNA表达模式所形成的网络式调节能够特定地改变大多数急性或慢性肝脏疾病，在肝纤维化中，miRNA通过调控不同信号分子或改变疾病某一过程表现出抵抗或促进肝纤维化的能力，同时miRNA在外源性药物或抑制剂干扰下的表达也能作为肝纤维化治疗的潜在位点。

3.1miRNA促进肝纤维化 miR-155在炎症反应中起重要作用，可参与脂肪性肝炎和肝纤维化等肝损伤过程，具有促进与抑制纤维化的双重作用[30-32]。Bala等[32]发现，酒精性肝病小鼠模型的miR-155上调，而敲除miR-155后，小鼠肝细胞与巨噬细胞中过氧化物酶体增殖物激活受体反应元件和过氧化物酶体增殖物激活受体α基因结合增加，肝脏炎症减轻，肝纤维化缓解。此外，在酒精性肝炎大鼠中，沉默miR-155可上调细胞因子信号转导抑制因子1，使促分裂原活化的蛋白激酶信号通路失活，抑制酒精性HSC增殖，促进凋亡[31]，提示外源性miR-155的表达降低可作为减轻肝纤维化的一种治疗方式。

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染时，肝脏大量产生miR-192，Kim等[25]采用体外共培养HCV感染肝细胞及人源HSC系LX-2细胞的实验发现，HCV诱导肝细胞产生并释放外泌体miR-192，随后激活HSC，同时外泌体miR-192通过转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-β1刺激人原代HSC转分化为肌成纤维细胞。病毒诱导的miR-192通过下调锌指E盒结合同源蛋白1刺激TGF-β1转录增加，miR-192与TGF-β1形成的正反馈环放大了TGF-β1在病毒感染中的促炎作用[33]，提示病毒可诱导miR-192产生，并促进病毒性纤维化的发展。

miR-199在肝病发展中起正向作用。一项埃及的临床研究显示，HCV感染患者血清miR-199显著上调，血清miR-199水平诊断晚期肝纤维化的灵敏度和特异度均较高[34]。Yang等[35]发现，TGF-β诱导转录因子Twist1表达增加，通过驱动HSC中miR-199a-3p上调，促进纤维化的发生发展，该效应由miR-199a-3p靶向抑制小窝蛋白2使TGF-β信号增强而产生，提示沉默miR-199可能是有效治疗肝纤维化的方法之一。

miR-34a/沉默信息调节因子1/p53信号通路在肝纤维化中发挥作用。Tian等[36]在共培养的肝细胞与HSC中发现，肝细胞中miR-34a/沉默信息调节因子1/p53信号通路激活后，凋亡肝细胞及活化HSC增加，肝纤维化发展。miR-34a与慢性丙型病毒性肝炎进展为早期或晚期肝纤维化具有相关性。Li等[37]的研究显示，慢性丙型病毒性肝炎患者血清高miR-34a水平与低生存率相关，肝纤维化程度越重，miR-34a水平越高，沉默信息调节因子1下调以及乙酰化p53上调越显著，慢性丙型病毒性肝炎向肝纤维化进展越迅速，说明miR-34a可作为预测肝纤维化发展的指标。

3.2miRNA抑制肝纤维化 miR-122是成人肝组织中表达最丰富的miRNA，约占肝脏总miRNA的70%[38]。Cheng等[39]发现，miR-122可抑制TGF-β1/Smad4信号诱导的上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)过程，并负向调控HSC的活化。miR-122也可通过参与肝脏慢性炎症及脂质代谢起作用，Satishchandran等[16]发现，酒精可使人和动物肝脏中具有肝细胞特异性的miR-122表达减少，进而促进缺氧诱导因子-1α与过氧化物酶体增殖物激活受体γ的表达，导致脂肪变性及炎症发生，使酒精性肝病逐渐发展为肝纤维化，而miR-122水平的恢复可抑制以上途径，改善酒精性肝损伤。另有研究表明，抑制肝脏模型中miR-122的表达可导致肝脏炎症、坏死、脂肪变性[40]，提示维持肝脏miR-122较高水平有利于延缓肝炎患者的肝纤维化进展。

纤维化肝脏中miR-29家族(包括miR-29a、miR-29b、miR-29c)显著下调，其中miR-29a表现最明显。miR-29a通过抑制CD36改善高脂饮食诱导肝纤维化模型小鼠皮下、内脏和肠道脂肪累积和肝细胞的脂肪变性，使小鼠体重减轻，而过表达miR-29a在EMT和肝纤维化中发挥保护作用[28]。Matsumoto等[41]对四氯化碳以及硫代乙酰胺肝纤维化小鼠模型的实验分析发现，miR-29a可直接靶向抑制Ⅰ型胶原A1和血小板源性生长因子C信使RNA的表达，减少ECM的产生，抑制细胞增殖和分化，同时miR-29a可通过提高胱天蛋白酶9的活性诱导LX-2细胞的凋亡，改善小鼠模型的肝纤维化程度。Yang等[42]证明，静脉注射miR-29a可通过直接靶向抑制磷脂酰肌醇-3-激酶p85α减轻胆管结扎诱导的胆汁淤积性肝损伤和纤维化。由此可见，在不同致肝损伤物诱导的肝纤维化模型小鼠中，miR-29a均表现出对肝纤维化过程关键步骤的抑制作用，提示可使用一种miRNA改善不同原因引起的肝纤维化。

miR-30a可减轻肝纤维化。Chen等[29]发现，通过结扎胆管或四氯化碳诱导而建立的肝纤维化模型的miR-30a表达下调，而靶蛋白Beclin-1表达增加。采用miR-30a模拟物使miR-30a在体外培养HSC中高表达，进而使ECM产生减少，HSC脂质累积增加，而敲除Beclin-1后，纤维化标志物α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原和组织金属蛋白酶抑制剂1、自噬标志物微管相关蛋白1轻链3Ⅱ/Ⅰ蛋白均表达下调，说明miR-30a可抑制Beclin-1介导的自噬，可在一定程度上发挥抗纤维化作用[29]。miR-30a过表达可通过靶向结合Snail抑制EMT过程，进而抑制HSC活化[43]，天然药物胸腺醌可上调miR-30a的表达，通过作用于EMT发挥抗纤维化作用[44]。

miR-155具有抗纤维化的潜能。研究表明，miR-155在肝硬化患者血清及活化的HSC中表达降低，miR-155通过靶向激活血管紧张素Ⅱ受体1与T细胞因子4参与EMT和胞外信号调节激酶1信号通路；而在HSC-T6细胞中，转染的miR-155可通过促进胱天蛋白酶3表达并降低B细胞淋巴瘤-2水平，抑制活化的肝成纤维细胞增殖，并诱导HSC凋亡，提示miR-155可能成为肝纤维化治疗的潜在靶标[45]。

此外，其他miRNA亦可抑制肝纤维化发展，如miR-194能够抑制HSC的活化和增殖，抑制癌基因蛋白激酶B2，部分减轻肝纤维化[46]；中性粒细胞来源的miR-223通过抑制非酒精性脂肪性肝炎向纤维化的发展发挥抗炎作用[47]；miR-876通过骨膜素抑制EMT状态以及肝纤维化向肝癌的发展，影响肝细胞癌的侵袭、转移和预后[48]；miR-455-3p通过抑制热激转录因子1的表达减缓HSC的激活及肝纤维化[49]。以上研究提示，内源性或外源性干扰miRNA表达可作为治疗肝纤维化的潜在途径，为临床药物开发提供基础。

4 基于miRNA诊断治疗肝纤维化

4.1基于miRNA的肝纤维化评估 正确有效的肝纤维化评估有利于预测、治疗、监测慢性肝病。肝脏组织活检为有创检查，具有一定风险，虽有助于明确肝病类型及进展，但只能检测某一时间点的情况，结果具有一定的主观性[50]。基于血液生物标志物和瞬时弹性成像技术的非侵袭性检测手段对纤维化程度随时间的细微变化不敏感，难以判断疾病进展过程[50]。

血液或其他体液中的miRNA随时间变化，且不同疾病进程具有特征性改变，如血清外泌体miRNA可用于肝纤维化疾病分级，外泌体miR-92a-3p、miR-146a-5p和miR-532-5能够区分Ⅰ～Ⅲ级肝纤维化患者以及健康者；轻型(0～Ⅰ级)和重型纤维化(Ⅱ～Ⅲ级)可通过血清外泌体miR-146-5p水平进行判断[15]。Abdel-Al等[23]的实验表明，在HCV相关肝纤维化肝组织中，miR-16、miR-146a-5p、miR-122、miR-222表达上调，且在早期和晚期肝纤维化中均显著上调；与miR-16、miR-146相比，miR-221/222诊断晚期肝纤维化的灵敏度和特异度更高，可作为预测HCV诱导的肝纤维化和预后的生物标志物。

miRNA能够发挥抑制或促进肝纤维化的作用，且循环miRNA水平在肝纤维化发展中的变化趋势稳定[19-22,25,28-29]，故检测循环miRNA有助于更好地诊疗疾病，且检测标本易收集、对患者无伤害、风险较低或无风险，可作为疾病进展及预后判断的指标，并具有肝组织活检、血液生物标志物、瞬时弹性成像等临床常用指标的优点[50]。由于体液miRNA水平受患者机体内环境的影响，同一时间个体间以及不同时间同一个体的miRNA差异较明显，故同一疾病不同病程不同患者体液miRNA水平的变化难以统一，未来不同人群miRNA的标准检测仍需深入研究。

4.2基于miRNA的肝纤维化治疗 目前，肝纤维化的治疗策略是针对原发病的病因治疗、抗炎治疗以及其他抗纤维化治疗[3]。由慢性病毒性肝病引起的肝纤维化可使用抗病毒药物，在肝炎病毒慢性感染阶段直接使用抗病毒药物，使病毒产生持续性病毒应答，可直接显著减轻肝炎病毒感染程度，临床常用利巴韦林、恩替卡韦等抗病毒治疗药物[51-52]，但由于药物在体内循环运输过程中可能有损失，不同患者的有效治疗药物剂量不同，故给药方式及治疗剂量应个体化。靶向抑制与HCV感染进展紧密相关的miR-122、miR-192、miR-221/222等可能是一种有效的治疗方式[23,53]。对于非酒精性或酒精性脂肪性肝病患者，可早期进行人为干预，如改变生活方式、保持正常体重等；对于自身免疫性肝炎患者，可使用免疫抑制剂等。其他可减轻肝纤维化状态的治疗方式包括诱导活化HSC凋亡[20]、抑制活化HSC的细胞因子[54]等。miRNA可通过TGF-β1/Smads信号、核因子κB信号及胞外信号调节激酶发挥抗炎、抑制HSC活化、减少肝细胞凋亡的作用，进而减轻肝纤维化[10]，与Sun等[55]从老鼠簕(Acanthus ilicifolius)筛选的有效成分4-羟基-苯并唑-2-酮在肝纤维中的作用类似。某些药物的肝脏毒性作用较大，其应用受限，同时针对肝纤维化原发病的治疗药物的有效性随时间及病程变化而逐渐降低，因此以miRNA为基础开发安全有效的新型治疗药物在控制肝纤维化方面有广阔的应用前景[10]。

5 小 结

miRNA调控网络在肝纤维化发生发展过程中起重要作用。随着高通量组学及其他相关技术的发展，有病理意义且在肝脏疾病中具有明确特异性调节功能的miRNA不断被发现，这些miRNA具有肝纤维化诊断分级、治疗及预后监测的潜力，对未来临床治疗方案的制订有一定帮助。目前，肝纤维化中miRNA作用的研究多集中于单个miRNA及其具体机制的临床前作用，对临床中miRNA调控作用的研究较少，miRNA作为新的非侵入性肝纤维化早期诊断生物标志物的有效性、特异性、敏感性还需进一步验证。