ω-3多不饱和脂肪酸与卵母细胞质量相关性研究进展

郭子瑜，钱云

(南京医科大学第二附属医院生殖医学中心，南京 210011)

随着人类辅助生殖技术的不断发展，与卵母细胞质量相关因素的研究越来越受到关注。虽然体外培养条件可能对早期胚胎的发育潜能具有一定影响，但卵母细胞质量是决定卵母细胞能否发育至囊胚的关键因素[1]。作为卵母细胞直接和必要的微环境，卵泡液通过各种代谢产物的累积为卵母细胞提供营养物质和生长因子，促进其生长发育[2]，因此卵泡液的组分变化对卵母细胞质量至关重要。在卵泡液的脂质组成成分中，饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸被认为是一次性能源，而多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFAs)则具有持续而广泛的作用[3]。PUFAs主要包括ω-3PUFAs和ω-6PUFAs，其中ω-6PUFAs与女性生殖系统疾病关系的研究已较为成熟，而ω-3PUFAs与女性生殖领域关系的研究相对较少。ω-3PUFAs在促进人体健康、降低疾病风险方面均具有重要作用，如改善乳腺癌[4]、心脑血管疾病[5]及糖尿病[6]的发生发展等。近年来，ω-3PUFAs在女性生殖系统疾病中的研究也逐渐深入。ω-3PUFAs广泛存在于卵泡液及卵母细胞中，是卵泡形成过程中细胞增殖所必需的能量储备分子，可调节卵泡的生长及成熟，ω-3PUFAs组成、浓度和相对丰度的改变与卵母细胞质量密切相关，影响女性生育能力[7-8]。但目前关于ω-3PUFAs改善卵母细胞质量的研究结果并不一致，还需要进一步深入研究加以验证。现就ω-3PUFAs与卵母细胞质量相关性的研究进展予以综述。

1 ω-3PUFAs概述

ω-3PUFAs是维持人体正常生长发育所必需的脂肪酸，主要通过饮食或营养补充获得。ω-3PUFAs主要包括α-亚麻酸(α-linolenic acid，ALA)、二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)。ALA广泛存在于植物油、海洋藻类和天然草本植物中，如亚麻籽、核桃和大豆油；EPA和DHA主要存在于鱼油中，如鲑鱼、沙丁鱼和鲱鱼油。ALA是合成一系列长链ω-3PUFAs的前体，在肝脏中通过去饱和以及延长反应转化为EPA和DHA；日常饮食中富含的亚油酸可与ALA竞争性抑制合成长链ω-3PUFAs的关键酶Δ6-脂肪酸去饱和酶，因此，在人体中只有约8%的ALA转化为EPA，不足4%的ALA转化为DHA[9]。

ω-3PUFAs以乙酯、三酰甘油和磷脂为主要存在形式，因此其生物利用度也不同。与乙酯形式的ω-3PUFAs相比，三酰甘油形式的ω-3PUFAs具有更好的生物利用度，而磷脂形式ω-3PUFAs的生物利用度目前尚不明确[10]。研究发现，纳米乳液系统可提高长链ω-3PUFAs的生物利用度，但目前纳米乳液的制备和加工方法均可能影响ω-3PUFAs的氧化稳定性[11]，因此改良ω-3PUFAs纳米乳液可能是未来ω-3PUFAs相关制剂的研究方向。

2 ω-3PUFAs对卵母细胞的影响及相关机制

2.1ω-3PUFAs调节卵母细胞质量相关脂质代谢 脂质代谢是卵母细胞成熟过程中的重要能量来源，卵母细胞及其周围卵丘颗粒细胞内的脂质代谢与卵母细胞质量及胚胎发育密切相关。在卵泡微环境中，影响卵母细胞质量的相关脂质代谢主要包括类固醇激素的生成和脂质含量的改变。卵巢类固醇激素的生成可调节卵泡发育、卵母细胞的减数分裂成熟以及胚胎质量。研究表明，体液循环中的ω-3PUFAs可通过调节类固醇激素代谢过程中的关键酶影响卵母细胞、胚胎和胎儿的发育[12]。Wang等[13]给成年大鼠膳食中添加DHA补充剂，48 h后(血浆DHA半衰期约为1.63 d)，与基础饮食组大鼠相比，DHA饮食组大鼠血清三酰甘油水平降低；进一步通过非靶向代谢组学分析大鼠血清样本发现，DHA的代谢效应与花生四烯酸、类固醇激素和多胺代谢相关，推测DHA通过自身代谢及协同其他脂类物质调节脂质代谢而发挥一系列有益作用。此外，在雌兔胚胎着床前(人工授精5～7 d)和着床后(人工授精7～14 d)补充DHA和EPA，可提高血浆孕酮水平，有利于增加胚胎植入后的存活率并促进胎盘形成[14]。哺乳动物卵母细胞中的脂质水平反映了脂肪酸β-氧化的程度，脂质水平过高可导致内质网应激、氧化应激和DNA损伤等，从而降低卵母细胞质量[15]。在猪卵母细胞体外成熟培养基中添加低水平DHA培养44 h后发现，卵母细胞及第7天囊胚中的脂质水平显著降低，而卵裂率和囊胚细胞数目显著增加，表明补充DHA可能通过降低卵母细胞及胚胎中的脂毒性，促进猪卵母细胞成熟并提高其发育潜能[16]。然而，Oseikria等[17]指出，高浓度DHA可导致颗粒细胞中脂质和类固醇激素代谢紊乱，从而降低卵母细胞的质量。Nikoloff等[18]研究发现，在培养基中添加高水平EPA后，卵母细胞内脂质水平降低且脂质滴形态改变，同时卵母细胞成熟率降低，但抗氧化剂可改善这一结局，虽然EPA可在一定程度上降低卵母细胞内的脂毒性，但卵丘卵母细胞内的氧化应激水平仍较高，减弱了其对卵母细胞的有利影响，甚至最终表现出一定的损害作用。由此认为，低剂量的ω-3PUFAs可通过调节脂质代谢提高卵母细胞质量、促进胚胎发育，同时对妊娠结局产生有益影响，但ω-3PUFAs浓度过高则可能会对卵母细胞产生不利影响。

目前关于ω-3PUFAs作为卵母细胞内脂质代谢调节剂的研究相对较少，且研究结论尚未统一，未来仍需更多设计严谨的实验进一步确定不同类型、不同浓度的ω-3PUFAs对卵丘卵母细胞内脂质水平及脂质代谢相关基因表达水平的影响，并评估其对卵母细胞成熟及胚胎发育的作用。

2.2ω-3PUFAs影响卵母细胞内前列腺素(prostaglandin，PG)的生成 ω-3PUFAs不仅是体内各种生理过程的重要能源，还是PG合成的直接前体。PG是由细胞膜磷脂、磷脂酰乙醇胺以及磷脂酰肌醇释放的PUFAs通过磷脂酶A2作用生物合成的一种脂类激素，参与调节卵丘-卵母细胞复合体的扩展以及卵母细胞的成熟，是哺乳动物排卵的中枢调节因子。PG主要包括5种类型，即PGE2、PGD2、PGF2α、PGI2和血栓素，其中PGI2、PGE2及PGF2α的生成与女性生育能力的关系研究较为广泛。

ω-3PUFAs衍生的PGI2通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator activated receptor，PPAR)参与胚胎的发育和着床[19]；PGE2则通过结合卵丘颗粒细胞上的G蛋白偶联受体介导自分泌或旁分泌调节途径，诱导促排卵相关基因表达并提高卵母细胞内环腺苷酸水平，在卵母细胞减数分裂成熟、卵丘颗粒细胞扩展以及卵泡破裂等排卵级联过程中起重要作用[20]。研究表明，在体外培养液中添加ALA可增加卵丘-卵母细胞复合物中PGE2合成并提高环腺苷酸水平，促进卵母细胞核成熟，而添加PG环加氧酶2抑制剂NS-398则可显著降低卵母细胞成熟率[21]。PGF2α是重要的外周循环炎症标志物，通过干扰发情周期、分娩过程和胚胎存活而影响生殖结局。有研究报道，高水平ω-3PUFAs的摄入与PGF2α水平呈负相关，因此ω-3PUFAs可能发挥抗炎作用[22]。此外，ω-3PUFAs还可通过影响PG合成过程中的关键酶，间接影响PG的表达。环加氧酶2是体内合成PG过程中的限速酶，ω-3PUFAs可通过调节卵母细胞中环加氧酶2的活性和相关基因的表达，减少其下游2系列PG(如PGF2α)生成，促进炎症生物效价低的3系列PG产生，最终降低卵母细胞内的炎症反应[23]。另有研究表明，EPA和DHA能够产生具有抗炎作用的保护蛋白和具有抑炎作用的溶解素，以抑制炎症反应，成人每天摄入EPA与DHA的总量>2 g可能起到抗炎作用[24]，但目前关于ω-3PUFAs相关制剂的剂量学研究仍处于起步阶段。综上，ω-3PUFAs可通过直接或间接调节不同亚型PG的生成，增加促排卵相关基因的表达，减轻炎症反应，对卵母细胞成熟及发育潜能产生积极影响。

2.3ω-3PUFAs改变卵母细胞膜的组成和功能 ω-3PUFAs是哺乳动物细胞膜磷脂双层结构的重要组成部分，不仅可为膜蛋白(如受体、转运蛋白、通道蛋白及黏附蛋白)提供最佳的支架，还可作为许多信号通路中各种亲脂性配体的前体[25]。ω-3PUFAs的含量和类型不仅影响卵巢类固醇激素的合成，还可影响卵母细胞成熟、子宫功能及妊娠结局。有研究指出，饮食中ω-3PUFAs含量及类型的变化可导致卵母细胞膜中ω-3PUFAs含量及类型的相应改变[26]，影响卵母细胞膜流动性、细胞内信号的转导和氧化损伤的易感性[7]，最终影响生殖结局。

在辅助生殖过程中，低温冷冻保存技术广泛应用于卵母细胞和胚胎的保存，伴随该技术产生的不良后果主要包括低温损伤和低温保护剂的毒性作用。目前的实验方法仍无法规避这些问题，未来需要开发新的策略来提高低温保存的效果。在低温冷冻等应激状态下，卵母细胞膜的组成及完整性是保护其发育能力不受损害的基础。研究发现，补充ω-3PUFAs可增加血浆和卵丘颗粒细胞中长链ω-3PUFAs含量，维持低温处理后卵母细胞膜的完整性，提高基础卵泡数和优质卵母细胞数，改善低温冷冻后的卵母细胞质量[27]。在Δ6-脂肪酸去饱和酶缺陷小鼠模型中，自幼鼠培养开始，持续补充花生四烯酸和DHA至成年，可重塑PUFAs缺乏小鼠的卵巢和睾丸膜脂质体，促进卵巢周期中的正常缝隙连接网络重组和支持细胞-血-睾丸屏障的重建，表明花生四烯酸和DHA是女性卵巢及男性睾丸膜磷脂体和鞘磷脂体中的关键结构[28]。此外，Moallem等[29]研究显示，卵丘-卵母细胞复合物可选择性地摄取不同类型的ω-3PUFAs，与短链ω-3PUFAs(如ALA)相比，长链ω-3PUFAs(如EPA和DHA)更易进入卵母细胞。卵母细胞的这种选择性功能表明卵母细胞膜对脂肪酸组成变化高度敏感，可能导致与功能特性相关的膜流动性变化，说明卵母细胞膜上可能存在某些影响卵母细胞成熟及发育的保护性分子机制，但目前具体机制仍不明确，还有待进一步研究。

2.4ω-3PUFAs调节卵母细胞内氧化应激水平 在卵母细胞内，线粒体参与调节ATP生成、钙稳态、氧化应激水平、细胞内多种信号转导及细胞凋亡。卵母细胞内氧化应激水平的调节对卵母细胞核成熟至关重要，氧化应激的产生与抗氧化能力的不平衡可能导致DNA损伤和细胞凋亡。Marei等[30]在牛卵母细胞体外成熟培养基中添加低浓度ALA，结果显示，在不影响卵母细胞内线粒体分布和含量的情况下，ALA可通过降低氧化应激水平促进细胞核成熟，最终提高卵母细胞成熟率。另有研究表明，在牛卵丘-卵母细胞复合体体外成熟培养基中添加高水平非脂化脂肪酸(棕榈酸、硬脂酸和油酸)后，卵母细胞内氧化应激水平升高、囊胚率降低以及囊胚细胞凋亡标志物表达增加，即发生卵母细胞发育潜能损害；而联合添加生理浓度的ALA后，卵丘颗粒细胞中线粒体膜电位在一定程度上恢复正常，导致细胞内氧化应激水平降低，有助于减少卵丘颗粒细胞凋亡且部分恢复卵丘颗粒细胞扩展能力，最终改善卵母细胞在脂毒性条件下的发育能力[31]。然而，Wakefield等[32]给予小鼠补充相对高水平的ω-3PUFAs，结果显示，高水平ω-3PUFAs饮食组小鼠卵母细胞内的线粒体分布和钙水平发生改变，氧化应激水平升高，导致卵母细胞受精后的囊胚率降低，胚胎畸形率显著升高。

目前关于ω-3PUFAs影响卵母细胞内线粒体功能及氧化应激水平的研究结果不一致，主要原因可能为实验中补充的ω-3PUFAs水平不一。适宜剂量的ω-3PUFAs可能有利于降低卵母细胞内氧化应激水平，改善卵母细胞质量，而过量ω-3PUFAs则可能损害卵母细胞的成熟及发育潜能。ω-3PUFAs补充剂量与卵母细胞内氧化应激水平的关系仍需更多研究证实，ω-3PUFAs对卵母细胞质量及女性生育能力改善均具有重要意义。

2.5ω-3PUFAs激活卵母细胞促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)信号通路 MAPK信号通路是一种高度保守的、重要的细胞内信号转导通路，参与调节细胞的多种生理功能。MAPK通路激活在卵母细胞减数分裂恢复、卵丘颗粒细胞扩展以及排卵事件中均具有重要作用。MAPK可调控卵母细胞减数分裂过程中纺锤体的组装、维持染色体的正常排列，并参与维持减数分裂中期阻滞等微管动力学的调节[33]。MAPK通路激活可导致其他蛋白激酶通路激活，并通过调节卵丘颗粒细胞与卵母细胞间缝隙连接的通透性影响减数分裂，抑制物质的运输，同时通过调节相关基因转录活性影响甾体激素的产生、卵丘颗粒细胞外基质蛋白的合成以及各种成熟调节分子的活性[34]。研究显示，DHA通过结合卵母细胞表面非脂化脂肪酸受体4激活MAPK相关信号通路，提高牛卵母细胞成熟率及受精后的囊胚率，而对卵丘-卵母细胞复合物中的脂质水平及脂质代谢相关的基因表达无显著影响[26]。Marei等[21]研究发现，补充ALA可增加卵丘颗粒细胞中的环腺苷酸水平，引起卵丘-卵母细胞复合物中MAPK1和MAPK3磷酸化，提高卵母细胞核成熟率并改善早期胚胎发育。Lee等[35]研究显示，ALA可通过激活MAPK信号通路促进卵母细胞核成熟、增加谷胱甘肽含量、促进卵母细胞胞质成熟。上述研究均证实，ω-3PUFAs可通过激活MAPK信号通路促进卵母细胞成熟及胚胎发育。

2.6ω-3PUFAs激活卵母细胞PPAR PPAR是一类多域蛋白质，属于核受体超家族。PPAR作为重要的细胞核转录因子，可调节一系列参与糖、脂代谢及炎症反应控制的相关基因的表达。PPAR主要包括3种亚型，即PPARα、PPARβ/δ和PPARγ。PPAR广泛表达于生殖系统各类器官中，包括下丘脑、垂体、卵巢、子宫和睾丸[36]。PPAR可与天然配体长链脂肪酸结合并实现活化，其中ω-3PUFAs因具有更高的亲和力，在微摩尔浓度下即可激活PPAR[37]。ω-3PUFAs可结合并诱导PPAR的构象变化，触发包括脂肪酸β-氧化及生成等多种代谢过程中特定基因的表达和转录，有助于维持卵母细胞内脂质代谢的稳态[38]。Idrees等[39]研究表明，PPARδ的激活可显著降低卵母细胞内脂质含量和氧化应激水平，维持脂肪酸分解与β-氧化过程的平衡，从而改善卵母细胞质量、胚胎发育及胚胎着床能力。此外，ω-3PUFAs激活PPAR可促进核因子κB的失活、增加抗氧化酶(如过氧化氢酶、超氧化物歧化酶或血红素加氧酶-1)的表达、降低活性氧类水平，从而抑制炎症反应，有利于卵母细胞成熟和胚胎发育[40]。另有研究显示，PPARα缺失对小鼠生育能力无显著影响，PPARβ/δ敲除小鼠在妊娠早期即出现胎盘畸形、胚胎死亡，而PPARγ可通过调节卵母细胞减数分裂成熟相关基因(如一氧化氮合酶)的表达促进卵母细胞成熟[41]。在猪胎盘早期形成过程中，PPARβ/δ和PPARγ的激活刺激滋养层细胞增殖，有助于胚胎着床及胎盘形成[42]。因此，ω-3PUFAs激活PPAR有利于卵母细胞成熟，改善早期胚胎发育，对胚胎植入及胎盘形成具有重要意义。

3 ω-3PUFAs在卵泡液中的作用

正常的母体代谢健康状态对于保障成功的排卵、受孕和胚胎发育至关重要。Matorras等[43]首次研究人卵母细胞中脂肪酸的组成，结果发现，饱和脂肪酸是受精失败卵母细胞中的最主要成分(79.22%)，其中硬脂酸(38.65%)和棕榈酸(32.66%)最为丰富，单不饱和脂肪酸(14.27%)中油酸含量最高(9.77%)，PUFAs则只占总脂肪酸的6.50%，ω-6PUFAs∶ω-3PUFAs=7.73，EPA∶DHA≈5。但由于存在伦理等问题，临床研究中直接获取卵母细胞进行成分测定并不可行，而在辅助生殖技术开展过程中，卵泡液的获取十分简易；同时，母体血清代谢物的变化常反映在卵泡液中[44]，影响卵泡健康、卵母细胞成熟以及随后的胚胎发育，因此卵泡液的组分分析是最常用的评估卵母细胞质量的生物学指标。O′Gorman等[45]用气相色谱-质谱法分析体外受精患者卵泡液中PUFAs的含量发现，正常受精后卵裂组患者卵泡液中ALA和DHA水平均显著高于未卵裂组患者，表明ω-3PUFAs可能是预测卵母细胞发育能力的潜在非侵入性标志物，有助于体外受精过程中卵母细胞的选择。一项前瞻性队列研究显示，卵泡液与血清中的PUFAs浓度呈正相关，卵泡液中较高水平的油酸和EPA可提高卵母细胞发育能力，并可在一定程度上逆转饱和脂肪酸对卵母细胞质量的不利影响，改善辅助生殖结局[46]。但是，Ruiz-Sanz等[8]研究发现，卵泡液中的脂肪酸谱随着卵泡的生长发育而变化，ω-3PUFAs水平(特别是DHA水平)与女性年龄呈正相关，与获卵数、受精率及优质胚胎率均呈负相关。以上研究结果的差异可能与研究人群纳入标准、样本量及检测方法不同有关，未来仍需更多的研究证实ω-3PUFAs在卵泡液中的作用。总之，卵泡液中ω-3PUFAs水平有望成为预测卵母细胞质量的非侵入性手段，并可能为临床改善卵母细胞质量的相关干预措施提供指导。

4 小 结

不同浓度、物种及亚型的ω-3PUFAs对女性生殖的影响存在差异。代谢组学是一门新兴的寻找与疾病相关的生物标志物的研究方法，其因具有客观、准确及测量相对简单等优点而成为目前研究的热点。因此，临床上可以考虑使用代谢组学方法，在血清及不同人群卵母细胞发育的不同阶段测定ω-3PUFAs水平及亚型分布的差异，探索其是否可以成为预测卵母细胞质量的生物标志物。同时，临床ω-3PUFAs营养/药物制剂干预对改善女性生殖健康的必要性以及ω-3PUFAs制剂中适宜的ALA、DHA和EPA含量及比例等问题也亟待解决。未来仍需更多的体内及体外实验研究进一步证实ω-3PUFAs对卵母细胞成熟及发育潜能的影响及作用机制，以改善卵泡微环境并提高卵母细胞质量，最终改善女性生育能力。