铜绿假单胞菌基因分子分型技术的研究进展▲

蓝如束 罗 丹 何本进 黄盼柳

(1 广西壮族自治区江滨医院检验科，南宁市 530021，电子邮箱：gxlrshu@163.com；2 广西中医药大学公共卫生与管理学院生物统计学教研室，南宁市 530200)

【提要】 铜绿假单胞菌是医院常见的条件致病菌，同时也是造成院内感染的重要病原菌，可引起多种疾病，严重感染时可危及患者生命。基因分子分型技术是追踪感染源及分子流行病学分析的重要手段，对于控制医院内感染、确定流行菌株具有重要意义。本文就铜绿假单胞菌基因分子分型技术的研究进展进行综述。

铜绿假单胞菌是一种非发酵的革兰氏阴性杆菌，也是常见的条件致病菌，其致病性较强，可引起多种疾病，如囊性纤维化、肺炎、尿路感染、外耳炎、伤口感染、骨和关节感染、菌血症和全身性感染等，严重感染时可危及患者生命[1-3]。国际医院感染控制联盟对全世界703个重症监护病房进行了监测，发现铜绿假单胞菌是引起院内感染的最主要病原菌，其次是鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯氏菌[4]。全国细菌耐药监测报告显示，在临床分离的细菌中，铜绿假单胞菌分离数量排名第四(8.76%)[5]。由此可见，铜绿假单胞菌的感染是不容忽视的问题。近年来，耐多药和广泛耐药铜绿假单胞菌的出现，给临床治疗带来很大的困难，同时也成为全球公共卫生问题[6]。随着分子分型技术的快速发展，临床上分子分型技术可用于铜绿假单胞菌的分子分型和同源性分析，对于判断感染来源、切断传播途径、控制感染蔓延具有非常重要的意义。本文就目前铜绿假单胞菌分子分型技术的研究进展进行综述。

1 随机扩增多态性DNA

随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)是由美国科学家Williams等[7]在1990年发明的一种基因分型方法，是基于PCR技术的一种分子生物学方法，可对未知基因组序列的物种进行多态性分析。该方法以DNA单一引物为模板，通过PCR扩增后经凝胶电泳获得非特异性条带，若条带相同则可判断为同源菌株[7]。RAPD具有稳定性较好，分辨率高，不需明确基因组序列即可进行分型，对DNA模板要求质量不高，操作简单等优点。但也存在重复性稍差，不同实验室间的结果以及流行菌株特征难以比较的缺点[8]。该方法广泛应用于追踪医院院内感染传染源和疫情处置。Trautmann等[9]利用RAPD检测重症监护病房患者病灶和自来水中铜绿假单胞菌的基因，发现有50%的铜绿假单胞菌有相同基因，认为病房的自来水可能是引起患者铜绿假单胞菌感染的主要原因。有学者[8]通过RAPD发现铜绿假单胞菌常见基因型对抗生素的耐药程度和毒力较强，耐药菌株易发生医院院内感染[10]。

2 多位点序列分型

多位点序列分型(multilocus sequence typing，MLST)是于1998年提出的一种基于核酸序列测定的细菌分型方法，该方法是在多位点酶电泳法的基础上发展而来。MLST通过PCR扩增菌株的多个管家基因(每株菌株通常有七个或多个管家基因)，并对扩增产物进行测序，将测序数据上传至PubMLST数据库进行序列比对，鉴定菌株的等位基因型与序列类型，通过比较序列类型来判断菌株是否具有同源性，以此对细菌进行分型[11-12]。铜绿假单胞菌有acsA、aroE、guaA、mutL、nuoD、ppsA和trpE等7个管家基因[13]，其基因引物序列可在PubMLST数据库获取。MLST具有较强的种内分辨率，结果重复性好，在不同的实验室间有良好的可比性[14]。Gomila等[15]应用MLST对铜绿假单胞菌的遗传多样性进行分析，认为该方法可作为院内感染或疫情暴发的调查手段。Blanc等[16]应用全基因组测序与MLST两种方法对铜绿假单胞菌进行分子流行病学研究，结果显示两种方法的同源性分辨率相同。MLST的缺点是操作过程所需的仪器特殊、成本高、费时等，从而限制了其在医院的推广普及[17]。

3 肠杆菌基因间重复共有序列PCR

肠杆菌基因间重复共有序列PCR(enterobacterial repetitive intergenic consensus sequence PCR,ERIC-PCR)是一种基于PCR的扩增技术，其通过对细菌高度保守重复序列进行扩增，依据扩增条带的位置和数量来判断是否为同一基因型[18]。铜绿假单胞菌扩增引物序列为：上游引物5′-CACTTAGGGGTCCTCGAATGTA-3′，下游引物5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′[19]。ERIC-PCR法的优点是成本低，操作简单，具有良好的分辨率[20]；同时也存在以下局限性：基因组重复序列有可能出现突变、缺失等情况，造成扩增无条带现象；其次PCR产物的长度不能确定,可导致电泳条带出现显像模糊、缺失的现象[21]，影响结果的判断。临床上常用ERIC-PCR来判断菌株的同源性。Zarei等[22]应用该方法调查医院重症监护病房环境、住院患者和病房蟑螂的铜绿假单胞菌，共分离到109株铜绿假单胞菌，经ERIC-PCR法分析，结果显示，不同来源铜绿假单胞菌的分离株之间存在14个不同的基因组重复序列指纹图谱，表明住院患者、重症监护病房环境和病房蟑螂的分离株具有同源性关系。卢雯君等[23]对重症监护室分离到的112株耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌进行同源性分析，发现可将112株菌株分为5个基因型，菌株间呈高度同源性，认为病房内存在互相传播的可能。

4 脉冲场凝胶电泳

脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)是利用周期性交替变换电场方向分离大片段DNA的一种方法，在脉冲场凝胶电泳作用下，可有效分离10 kb至10 Mb大小片段的DNA分子，相近和相似的物种DNA分子将出现相似的图谱，以此判断其同源性[24]。标本电泳前需利用限制性内切酶将物种DNA分子消化分解成大小不一的片段；选择限制性内切酶时，对于已测序的基因组DNA，要求其具有相应的识别位点，但如果基因组DNA尚未测序，则可以根据生物体的G+C含量来选择限制性内切酶；铜绿假单胞菌常用的限制性内切酶为SpeⅠ或XbaⅠ[25]。因PFGE的分辨率高，可以对菌株大部分基因组(>90%)进行同源性分析,且不需要合成引物，其已成为医院感染暴发调查中分子流行病学研究的重要手段，也被誉为细菌分子分型的“金标准”[26]。但PFGE操作复杂、费时长(约2～3 d),且需要配备专业设备和操作熟练的检测人员；此外，其还存在电泳结果的影响因素较多(如电泳的电压和时间、电泳液的浓度和温度等)和重复性较差等缺点[27-28]。该方法常用于病原菌的同源性分析，对疫情处置和控制医院院内感染起到重要作用，同时还可用于监测土壤或水中的微生物。

5 多位点可变数目串联重复序列分析

多位点可变数目串联重复序列分析(multiple-locus variable-number tandem-repeat analysis,MLVA)是一种基于PCR检测数目可变串联重复序列的基因分型方法[29-30]，原理是通过PCR扩增串联重复区并测量扩增产物的大小，再通过凝胶电泳或高分辨率毛细管电泳确定每个位点的重复数，根据重复数区分等位基因，利用MLVABank公共数据库(http://mlva.i2bc.paris-saclay.fr/mlvav4/genotyping/)进行微生物基因分型，可以利用来自多个重复区域的一组等位基因对克隆群进行鉴定[29]。由于其操作简单、检测通量大、不需要配备特殊仪器、成本低、结果重复性好、分辨率高、在不同的实验室之间可相互比较等优点，已广泛应用于多种细菌的分子分型和溯源性追踪[31]。随着该技术越来越完善，MLVA已成为医院流行病学调查中主流的克隆性基因分型方法[32]。但缺点是一株菌株需要对多个位点进行扩增，存在检测工作量大等不足。

6 基于PCR的开放阅读框分型

基于PCR的开放阅读框分型(PCR-based open-reading frame typing,POT)是一种基于多重PCR技术检测多个开放阅读框(open-reading frame,ORF)分布情况的方法，其通过凝胶电泳来判断每个ORF是否缺失，结果以数据1和0的格式显示，通过十进制换算成POT数值[33]。铜绿假单胞菌是通过检测10个小基因岛ORF和7个基因岛ORF计算得到每株菌株的POT数值，POT数值相同的菌株可判断为具有同源性[34]。该方法具有操作简便、费用低、重复性好、检测时间短(约4 h)、实验室间的结果易于对比、设备需求简单(只需要普通PCR仪器和琼脂糖凝胶电泳设备)等优点，可以作为许多国家和地区普通临床微生物实验室的常规分子流行病学分析和鉴定细菌遗传谱系的方法[33]。但与PFGE和MLST相比，POT的分辨率略低[34]。Suzuki等[34]将POT应用于铜绿假单胞菌基因分型，通过对不同铜绿假单胞菌(PAO1、PA7、UCBPP-PA14和LESB58)全基因组序列的比较，筛选出17个ORF作为铜绿假单胞菌的标志物。

7 全基因组测序单核苷酸多态性分型

全基因组测序技术是通过对病原菌基因组进行测序，以获得有关病原菌检测、鉴定、分型和药物敏感性等信息[35]。全基因组测序的检测过程比较复杂，需要配备特殊仪器和软件，对检测人员能力要求较高[36]。近年来,随着测序技术的飞速发展，测试通量增加及成本的降低,该技术被广泛应用于临床和流行病学调查中[37]。全基因组测序的明显优势是在单次运行中可产生数百万个读数,然后通过专用处理软件进行组装,最终构建菌株基因组的完整核苷酸序列,其具有灵敏度和特异度较高、能够及时发现病原菌变异和新的病原体等优点[38]。但全基因组测序也存在以下的局限性[36,39]：不能检测标本中所有微生物，标本中含有低浓度微生物和难破壁的微生物时易出现漏检；不能分析特定耐药基因或毒力基因；数据处理及其分析需要具有生物信息学分析能力的技术人员等。

8 小 结

由于不规范使用抗菌药物而导致院内感染的情况时有发生，但目前细菌表型分型和分子分型技术均存在不足，因此未能满足临床应用。随着分子分型技术的快速发展，临床上迫切需要一种操作简便、分辨率高、重复性好、费用低、不同实验室间结果有可比性的分型方法。近年来，高通量全基因组二代测序在临床上普及应用，测序成本越来越低，全基因组测序分型将有望替代目前已有的分型方法。各医疗单位应该结合自身技术条件选择适当的分型方法确定感染源和传播途径，及时采取防控措施，减少感染的发生。