金属有机骨架固定脂肪酶的研究进展

陈文艺，陆启玉，钟南京*

1.广东药科大学 食品科学学院，广东 中山 528458

2.河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001

脂肪酶(lipase, EC 3.1.1.3)是一种三酰基甘油水解酶。脂肪酶可以催化水解、酯化、酯交换、氨解、醇解等诸多反应，除此之外还可以表现出其他相关活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、酰肽水解酶、胆固醇酯酶活性[1]。作为良好的生物催化剂，脂肪酶广泛应用于食品、制药、化妆品、洗涤剂、皮革、纺织和造纸等不同行业中[2]。然而，天然脂肪酶由于存在难溶于非水相、稳定性差、催化效率低、难以回收利用等缺陷，其在工业化大规模生产中的应用受到巨大的限制。酶的固定化技术在克服这些缺陷方面发挥着重要作用[3]。

固定化酶是指在物理上限制或束缚在一定的空间区域内并保留其催化活性，并且可以重复和连续使用的酶。将酶固定在固体载体上，能更有效控制反应过程并提高酶在储存和操作条件下的稳定性。此外，固定化酶的异相性使其更容易地从产品中分离出来，将污染最小化，而且回收固定化酶可以降低生产过程的成本[4]。除了固定化酶带来的潜在好处外，酶的化学和物理性质可能也会因固定载体和方法的选择而发生变化[5]。纳米材料具有粒径小、比表面积大、生物相容性等优点，被认为是固定化酶的理想载体[6]。为了提高酶的稳定性和活性，许多纳米材料已被用于固定化酶，比如碳纳米管[7]、石墨烯[8]、金属纳米颗粒[9]和金属有机骨架等。在这些纳米材料中，金属有机骨架是一种比较特殊的类别，因为它们具有最大的比表面积和最广泛的结构多样性。

金属有机骨架(metal-organic frameworks，MOFs)，又被称为多孔配位聚合物(porous coordination polymers，PCPs)，是由金属离子与有机配体通过配位作用形成的一种高度有序的多孔有机-无机杂化材料[10]。由于MOFs的金属节点和有机配体具有丰富的几何结构及两者连接方式的多样性，MOFs的结构可以根据特定的功能来设计合成[11-12]。MOFs的多样性使其在不同的应用领域得到了广泛的应用，比如在催化、燃料储存、分离和生物医学等[13]。MOFs具有比表面积大、孔隙率高、易于调整的孔径、易修饰的金属节点和配体以及合成条件温和等优点，因此是酶固定化的有效载体[14-19]。近年来，许多MOF-酶复合材料都取得了空前的成果，在众多方面都远远超过了游离酶，而MOFs作为酶固定化载体材料也越来越受到人们的欢迎[20-21]。作者综述了脂肪酶在MOFs上的固定化策略，并分析了不同合成方法的优势和局限性，还概述了MOF-脂肪酶复合物在生物催化领域的应用进展。希望为MOFs应用于脂肪酶固定化的进一步研究和促进其在生物催化领域以及工业应用提供有益的参考。

1 MOFs固定脂肪酶的方法

根据脂肪酶和MOFs的性质以及所需的应用，常见固定脂肪酶的方法主要包括表面吸附法、共价连接法、孔吸附法和共沉淀法。MOFs作为一种新型的多孔材料，具有极高的比表面积，依靠范德华力、氢键、π-π相互作用等相对较弱的物理作用力可以将脂肪酶固定到MOFs载体上，表面吸附的温和操作条件使其非常适合保留酶的结构和活性；MOFs的羧酸基团与脂肪酶表面上丰富的氨基以共价偶联结合生成的肽键则可以防止酶从MOFs中浸出；尤其是中孔的MOFs，脂肪酶在MOFs孔中的扩散(孔吸附)不仅可以使酶负载量增加，而且还可以防止酶从孔中浸出从而使酶更加稳定。共沉淀法的优势在于克服了脂肪酶尺寸限制对固定在MOFs上的应用，并且即使在苛刻条件下也能表现出色的稳定性。

1.1 表面吸附

表面吸附是MOFs固定脂肪酶最直接的方法，酶分子通过弱相互作用锚定在MOFs表面。该方法使用的MOF允许预先合成，从而使合成条件超过目标酶的变性范围。同时由于酶和MOF之间相互作用的非特异性，该方法对MOF要求较低(不需要孔径或特定官能基团)。

基于这一策略，Liu等[22]采用直接物理吸附法将猪胰脂酶(PPL)固定在一系列微孔MOFs上，这些MOFs包括UiO-66(Zr)、UiO-66NH2(Zr)、MIL-53(Al)和炭化MIL-53(Al)。在该研究中，他们首先将新合成的MOFs浸泡在甲醇和二甲基亚砜的PPL溶液中，然后用涡流混合1 h，最后离心得到PPL@MOF粉末。FTIR、XRD和SEM等结构表征证实了PPL成功地吸附在MOFs上，并且具有良好的稳定性和结晶度；并且PPL@MOF在48 ℃下储存35 d后，其催化合成华法林的产率仍超过65%。此外，Nobakht等[23]采用两种介孔MOFs材料(HKUST-1和MIL-100(Fe))对PPL进行固定化。PPL@HKUST-1和PPL@-100(Fe)在25 ℃下保存20 d后，分别保留了78%和90%的初始活性，而同样情况下游离脂肪酶只保留其初始活性的66%。Cheong等[24]用氢氧化铵(NH4OH)溶液对ZIF-8纳米颗粒进行改性，形成亲水性较强的胺官能化的ZIF-8(An-ZIF-8)。然后将An-ZIF-8与洋葱伯克霍尔德氏菌脂肪酶(BCL)混合，通过形成多点连接的氢键，将BCL固定在An-ZIF-8表面。由于亲水性的增加，BCL@AN-ZIF-8在油水界面处的分散性提高，有助于脂肪酶暴露其活性位点，从而保持高催化活性。此外，An-ZIF-8上官能团(NH2)的存在有助于提高BCL@An-ZIF-8的稳定性，并且可以防止BCL从An-ZIF-8表面上脱落。

在协同催化中，化学和生物催化剂的结合进行级联反应(Cascade Reactions)是改进化学合成的有力工具。但是，在级联过程中，生物催化剂和化学催化剂的不相容性通常会使两种催化剂失活[25]。Wang等[26]采用UiO-66-NH2逐步固定Pd纳米粒子(NPs)和假丝酵母脂肪酶B(CALB)制备了用于级联反应的生物杂化催化剂。微小的Pd NPs被吸附在MOF的内孔中，而CALB由于尺寸较大则被固定在MOF的表面。这种情况下，以MOF为载体的固定化可以使化学催化剂和生物催化剂在不同的位置进行分隔，从而避免它们相互失活以及提高其催化活性。

1.2 共价连接

相比于表面吸附，酶分子与MOFs的共价连接能够显著提高其稳定性及重复利用性。MOFs 表面含有大量游离的羧基、氨基和羟基等官能团，可以与酶表面的反应性基团，如氨基、环氧基或乙醛酸等发生共价连接。Jung等[27]首次通过EDC或DCC活化1D-MOF、2D-MOF和IRMOF-3暴露在外面的羧基，然后将其与CALB上的氨基进行连接。与游离酶相比，其活性提高了数百倍，且对映体选择性相同。此外，Zare等[28]合成了MIL-101(Cr)、NH2-MIL-101(Cr)以及TCT@NH2-MIL和Glu@NH2-MIL两种化学修饰形式的NH2-MIL-101(Cr)，并首次将其用作脂肪酶固定化载体。在该研究中，他们将合成的MOFs分散在PBS中，然后加入皱纹假丝酵母脂肪酶(CRL)溶液，放置后通过离心分离得到固定化酶。研究结果表明，所有固定化形式的酶活性及稳定性都有不同程度提高，特别是对于CRL@TCT@NH2-MIL和CRL@Glu@NH2-MIL。

除了MOFs 本身的游离基团和酶基团发生共价连接外，研究者还尝试了利用交联剂将酶固定在MOFs上。Chen等[29]用UiO-66-NH2成功固定了猪胰脂酶(PPL@MOF)，该工作利用戊二醛(GA)作为交联剂将酶分子与MOF表面氨基进行交联，其结果显示PPL@MOF具有较高的猪胰脂酶负载量(98.31 mg/g)和相对回收率(104.4%)。

目前，在一些研究中磁性纳米粒子(如Fe3O4)已经被成功地引入到MOF-脂肪酶复合材料中，使其更易于分离和重复使用。Wang等[30]通过层层组装的方法在羧基功能化的Fe3O4纳米粒子外包裹具有分级孔结构的MIL-100(Fe)，制备了磁性Fe3O4@MIL-100(Fe)复合微球。利用EDC/NHS或Zn2+活化后,通过共价结合或金属-离子亲和作用将皱纹假丝酵母脂肪酶(CRL)固定在复合微球上。同样，Samui等[31]采用Fe3O4纳米颗粒附着在NH2-MIL-88B(Fe)表面或镶嵌其内部合成了胺功能化磁性MOF，然后利用EDC激活CRL的羧酸官能团后将其固定在磁性Fe3O4@NH2-MIL-88B(Fe)表面。与游离脂肪酶相比，固定化脂肪酶均具有较高的催化活性、稳定性和重复利用性。

1.3 孔吸附

通过改变结构单元(金属或有机配体)可以合成不同孔径的MOFs，介孔MOFs可以将酶吸附到孔道中，实现酶的固定化。Lykourinou等[32]首次报道了将酶吸附在介孔MOF(Tb-mesoMOF)的孔道中，该介孔MOF与其介孔二氧化硅材料MCM-41相比，显示出优越的酶催化性能。脂肪酶被限制在MOFs的孔道或空腔中，有助于提高脂肪酶的稳定性并减少循环使用中的浸出。Dutta等[33]在合成ZIF-67的过程中加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，通过竞争配位以破坏部分咪唑-Co(II)联结，并在所得的DP-ZIF67晶体中产生大的介孔(>20 nm)。然后将Pd纳米粒子(NPs)和假丝酵母南极脂肪酶A(CALA)逐步吸附到DP-ZIF67介孔中，制备了基于介孔MOF的多级催化纳米反应器(MCNR)。

由于脂肪酶分子的尺寸比较大，直接合成稳定且足够大的孔来容纳脂肪酶的MOFs比较困难，因此近期有研究者提出利用无模板的合成策略来制备介孔MOFs用于固定脂肪酶。Cao等[34-35]采用无模板法在温和的条件下简便地制备了Cu-BTC层状多孔MOF材料，其中的纳米级微孔Cu-BTC颗粒堆积在一起形成介孔。然后采用物理吸附将修饰后的枯草芽孢杆菌脂肪酶(BSL2)固定在Cu-BTC上，循环使用10次之后，固定化BSL2仍具有较高的催化活性。这是首例在有机溶剂体系下把脂肪酶固定化在MOF材料中的工作。

1.4 共沉淀

由于到目前为止报道的大多数MOF的孔径都小于脂肪酶的大小，因此，需要采用多种策略来扩大MOF作为脂肪酶固定化平台的选择范围。最近，有研究者通过共沉淀策略来探索在MOF的框架内包埋脂肪酶。采取这个方法的关键是在室温条件下合成MOF，以便保持酶的活性和稳定性。

He等[36]通过简单研磨氧化锌、2-甲基咪唑和嗜热脂肪酶(QLM)与微量乙醇的混合物得到QLM@ZIF-8。系列表征证明，QLM成功嵌入到ZIF-8骨架中，而且QLM@ZIF-8在酯水解反应中表现出较高的催化活性和稳定性，同时在非水介质中动力学拆分仲醇方面表现出良好的对映选择性和重复利用性。Nadar等[37]还试验了用水代替化学溶剂进行ZIF-8共沉淀包埋脂肪酶过程的可能性，在该项工作中，通过超声波处理来提高黑曲霉脂肪酶的活性，然后将醋酸锌和2-甲基咪唑水溶液与酶溶液混合，离心分离得到ANL@ZIF-8复合物。Gascón等[38]采用共沉淀法将脂肪酶固定在半晶态Fe-BTC上，与合成法制备的Lip@MIL-100(Fe)相比，Lip@Fe-BTC在固定化率、催化活性、催化效率和防止酶脱落等方面均呈现出更好的效果。

核苷酸杂化金属配位聚合物(NMCP)具有良好的自适应自组装特性，已被广泛用于制备MOF-酶复合物[39-40]。Li等[41]以醋酸锌为金属离子和腺嘌呤为有机配体，通过共沉淀法固定产碱杆菌嗜热脂肪酶，所得QLM@Bio-MOF在高温、碱性条件下和金属离子存在下均表现出良好的催化活性和稳定性。同样，Li等[42]同时将柠檬酸修饰的Fe3O4纳米颗粒和皱褶假丝酵母脂肪酶(CRL)包埋在Zn/AMP纳米纤维载体中，得到具有磁性的MOF-脂肪酶复合物。所得Ca-Fe3O4@Zn/AMP凝胶不仅保留了Zn/AMP凝胶原有的纤维结构，而且磁性纳米颗粒的加入为其分离提供了方便。此外，Ca-Fe3O4@Zn/AMP凝胶具有良好的pH稳定性、热稳定性和储存稳定性。

2 MOF-脂肪酶复合物的特性

新型纳米材料MOFs 用于脂肪酶的固定化具有显著的特性，所得固定化酶在催化活性、选择性、热稳定性、pH稳定性、有机溶剂稳定性、储存稳定性、可重复利用性等酶学性能均有很大的提高。

2.1 催化活性

与游离脂肪酶相比，许多MOF-脂肪酶复合物均表现出较强的催化活性和选择性。MOFs作为一种新型的多孔材料，具有极高的比表面积和孔体积，极有利于脂肪酶的吸附和扩散，从而阻止不必要的酶自聚集，提高催化活性。在异辛烷溶液中，BSL2@Cu-BTC催化合成月桂酸苄酯的初始反应速率是游离BSL2的17倍左右[34-35]。CALB@IRMOF-3在保持原有对映体选择性不变的情况下，在有机溶剂(异丙醚)中的活性是游离酶的103倍[27]。除了在有机相中，在水相中也有一些催化活性增强的例子，如脂肪酶-脯氨酸@ZIF-8的催化活性为游离酶的135%[43]。

MOFs的功能可以通过亲水或疏水相互作用影响固定化酶的活性。如与PPL@UiO-66(Zr)相比，PPL@UiO-66-NH2(Zr)的转化率低11%，而固定在炭化MIL-53(Al)上的PPL比PPL@MIL-53(Al)的活性提高了5%[22]。由此可以看出，UiO-66(Zr)和炭化MIL-53(Al)的疏水性有利于疏水脂肪酶在MOF表面的吸附，并使酶活性位点暴露以至于有较高的催化性。

2.2 稳定性

脂肪酶的稳定性是扩大其在各个领域的适用性所要考虑的重要因素之一。当酶暴露于极端温度，极端pH值或有机溶剂中时，会使酶的构象发生改变，活性位点变形而导致酶活性降低。而将脂肪酶固定在MOFs上，能够使得在这些条件下酶的活性丧失最小，从而增强酶对变性条件的耐受性。由于载体和酶之间的多点连接，形成了稳定的构象，固定在Zn-(NH2-BDC) MOFs的CRL的热稳定性和pH稳定性与游离酶相比都有较大提高，而且储存49 d后其活性仍保持在初始活性的86%左右[44]。同样，CRL@TCT@NH2MIL和CRL@Glu@NH2-MIL在60 ℃和80 ℃下保持30 min,其剩余活性仍保留初始活性的85%以上；此外，CRL@NH2-MIL和CRL@MIL也有类似的抗热失活能力。然而，游离的CRL，在60 ℃下保持30 min只有初始活性的25%左右，且在70 ℃下完全失活[28]。这很可能是由于CRL与MOFs载体的共价连接而提供的酶的稳定性。此外，与游离酶相比，ANL@ZnGlu-MNPs在乙醇、乙酸乙酯、正己烷、乙腈等几种有机溶剂中都表现出较强的耐受性[45]。

2.3 重复利用性

相对于游离酶，固定化酶的最大优势之一就是它们的可重复利用性，这在MOFs作为载体材料中显得尤为突出，可大大降低其应用成本。一般来说，游离脂肪酶容易在有机溶剂中聚集，但由于BSL2完全分散在Cu-BTC分级多孔的内表面，从而有效防止聚集或其他失活现象。并且循环使用10次后，BSL2@Cu-BTC仍能保持90.7%的初始酶活性和99.6%的初始转化率[34-35]。同样，由于共价连接能够有效防止酶使用过程中的变性和脱落，CRL @PES-NH2-MIL在连续使用12次后仍能保持初始活性的50%，而CRL@PES只有20%[46]。

此外，在某些情况下，磁性Fe3O4被用于制备MOF-脂肪酶复合材料[30-31, 42,45]。这一策略使催化剂更容易分离，从而极大地提高了复合材料的重复利用性，特别是对于纳米尺度的小颗粒MOF-脂肪酶复合物。

3 MOF-脂肪酶复合物在不同催化中的应用

根据脂肪酶的性质，MOF-脂肪酶复合物在生物催化领域应用诸多，包括水解反应、酯化反应、酯交换反应、Michael加成反应、氧化反应和醇酰化反应等。

由于脂肪酶都具有水解活性，MOF-脂肪酶被广泛用于催化水解反应且表现出比游离酶更高的水解活性。如用CRL@Fe3O4@MIL-100(Fe)催化橄榄油水解反应，表现出较强的催化活性和稳定性，重复10次使用后，C-ICR和M-ICRL两种固定方式的剩余活力分别为74.04%和61.16%[30]。同样，固定在Zn-(NH2-BDC)MOFs上的CRL在水解对硝基苯丁酸酯反应中表现出良好的稳定性和催化活性，而且固定化CRL在重复使用10次后仍保持了其初始活性的79%[44]。

酯化反应是脂肪酶最常见的应用之一。在催化酯化合成肉桂酸苄酯反应中，对于PPL@PW@MIL-100(Fe)，肉桂酸的转化率为80.6%，而游离酶的转化率只有44.4%；并且在连续使用5次后，PPL@PW@MIL-100(Fe)仍保持了90.4%的初始活性，重复使用8次后活性仍保持在80.0%[23]。同样，用BSL2@Cu-BTC在异辛烷体系中催化合成月桂酸苄酯，在20 h后转化率便高达90%，而游离酶的不到10%；经过10次循环，BSL2@Cu-BTC仍然保持 90.7%的初始催化效率，酯化反应的转化率也高达初始值的 99.6%[34-35]。

MOFs固定脂肪酶用于催化酯交换也受到了许多研究者的关注。利用CRL@ZIF-8在Pickering界面催化体系中催化正丁醇和醋酸乙烯酯的酯交换反应，12 h内即可达到100%的转化率，但对于底物较大的3-(4-羟基苯基)丙烷-1-醇和月桂酸乙烯酯的酯交换反应，经过长时间的反应，而转化率只有不到3%[47]。这种催化差异与ZIF-8壳层的尺寸选择性导致底物与酶接触的位置不同有关。脂肪酸-CALB-ZrMOF催化(±)-1-苯乙醇和醋酸乙烯酯的酯交换在不同溶剂中表现出不同效果，在正己烷中，与ZrMOF偶联的脂肪酸越长，其转化率越高，最高可达2.4倍[48]。由此可以看出，CALB附近引入疏水分子可以改变局部环境，从而提高CALB的活性。此外，QLM@Bio-MOF在催化葵花籽油与甲醇的酯交换合成生物柴油中具有较好的性能，重复使用5次后，葵花籽油的转化率仅下降了约20%。这归因于脂肪酶在MOFs骨架中的分散性较好，对甲醇的抗性较强[41]。

除上述水解、酯化和酯交换反应外，MOF-脂肪酶还可用于Michael加成反应、氧化反应和醇酰化反应。与PPL@SBA-15相比，PPL@MOFs催化4-羟基香豆素与亚苄基丙酮进行Michael加成反应合成华法林，均表现出较高的催化活性和产率[22]。ANL@ZnGlu-MNPs在催化环辛烯环氧化反应中表现出较好的活性及操作稳定性，在重复利用10次后，该环氧化反应的相对产率仍然可以达到51.6%，并且几乎不影响产物的对映体选择性[45]。利用CALA@Pd@DP-ZIF67催化消旋反应和醇酰化反应制备对映手性乙酰化硝醇，转化率高于97%，且具有较好的重复利用性[33]。

4 展望

综上所述，MOFs作为一种新兴且优异的酶固定载体，凭借自身的独特性质，结合表面吸附、共价连接、孔吸附和共沉淀这4种固定方式，使得脂肪酶的性质如催化活性、选择性、稳定性以及可重复利用性得到极大改善，并推动了MOF-脂肪酶复合物应用于水解、酯化和酯交换等生物催化领域。从合成方法上看，不同的固定化策略各有优缺点。如由于酶与MOFs之间的弱非共价相互作用，通过表面吸附固定的脂肪酶在回收利用过程中可能会遭受明显的浸出。这在共价连接中不太明显，但MOFs与脂肪酶之间共价键的形成通常需要修饰活化，而这种方法相对复杂且容易引起酶活性的损失。这两种方法都会导致脂肪酶暴露于环境中而不受保护，容易受极端环境影响而导致变性。孔吸附能将脂肪酶有效固定在MOFs孔道或空腔中，显示出较强的再循环性能和对极端环境的抵抗力，但选择这种方法的前提是脂肪酶分子大小必须小于MOFs 的孔径尺寸。共沉淀可避免许多上述问题，但只能与具有温和合成条件的MOFs一起使用。

目前MOFs固定化脂肪酶还存在一些缺陷，然而与传统固定化载体相比，MOFs仍有许多优势。MOF-脂肪酶复合材料在水解、酯化和酯交换等生物催化领域中表现出良好的催化活性、选择性、稳定性以及重复利用性，具有巨大的应用前景，因此，MOF-脂肪酶复合材料在生物催化领域的应用是今后的研究方向之一。需要指出的是，这一研究领域仍处于初期阶段，拓展和探究MOFs 固定化脂肪酶在生物催化中新的应用途径和技术手段也是研究者今后亟待解决的关键问题。如设计具有大孔径的高介孔MOFs材料来容纳尺寸较大的脂肪酶，Deng等[17-18]采取延长有机配体的方法设计合成了孔径最大可达9.8 nm MOFs材料。但目前此方法有机配体的合成较为困难，设计不同的功能化MOFs材料以适应不同的催化体系，以及设计多种脂肪酶共固定在MOFs上用于级联反应以催化更加复杂的反应等。随着研究的逐步深入，MOF-脂肪酶复合材料的各种性能将会显著提高，在实用化和工业化应用方面的进一步发展值得期待。