蛋白质糖基化在肺癌诊疗中的研究进展

王祎熙，李霞，许玲

(1.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院肿瘤一科，上海 200437； 2.上海市闵行区中西医结合医院中医内科，上海 200241)

肺癌是全球范围内发病率、致死率均较高的恶性肿瘤[1]。2015年，我国新发肺癌病例约78.7万例，死亡病例约63.1万例，居我国恶性肿瘤发病和死亡人数的首位[2]。由于肺癌发病初期无明显症状，因此早期诊断率较低。低剂量CT检查的灵敏度较高，是目前肺癌早期筛查的主要手段，但对早期肺癌诊断的特异度较低[3]，且存在假阳性率高和过度诊断等问题。而临床常用的癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、细胞角蛋白19片段(cytokeratin-19-fragment，CYFRA21-1)、神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)、糖类抗原125(carbohydrate antigen 125，CA125)以及鳞状细胞癌相关抗原等肺癌血清肿瘤标志物的灵敏度均较低，均不可作为肺癌早期诊断的有效检测指标。因此，亟须寻找一种有效的肺癌早期诊断指标。在细胞生长、发育、分化各个阶段，糖基化修饰对蛋白质的结构和功能均具有调控作用，在肿瘤等病理状态下，糖链结构会发生改变，导致蛋白质结构和功能异常。而糖复合物糖基化修饰异常是肿瘤细胞的主要特征之一[4]。同时，药物的糖基化修饰可提高其对特定器官的靶向性，从而更好地发挥药物的靶向传递功能。现就蛋白质糖基化在肺癌诊疗中的研究进展予以综述。

1 蛋白质糖基化

蛋白质糖基化是重要的蛋白质翻译后修饰，具有广泛存在、结构复杂的特征，受一系列代谢和酶促反应网络以及基因、环境等因素共同调控[5]，从而改变蛋白质结构和功能。真核生物体内的结构蛋白、转录因子、受体蛋白以及一些重要的酶类均需经过特定的糖基化修饰，使结构多样化，从而具有更广泛的生物学活性[6]。在某些特定病理状态下，蛋白质的类型及数量均无显著变化，但糖基化结构却存在显著差异[7]。

根据连接的氨基酸残基不同，蛋白质糖基化可分为N-糖基化、O-糖基化和糖基磷脂酰肌醇，目前研究较多的为N-糖基化和O-糖基化。N-糖基化修饰是生物体内最丰富的蛋白质翻译后修饰之一，血浆等体液中的蛋白质多发生N-糖基化修饰，N-糖基化修饰在内质网表面经糖基转移酶催化形成N-连接聚糖分子，聚糖分子与新生成蛋白质的天冬酰胺残基通过N-糖苷键连接，随后进入内质网和高尔基体内进行一系列后续加工[8]。N-糖链家族由数目庞大的单糖构成，组成N-聚糖的常见单糖主要包括N-乙酰氨基葡萄糖、葡萄糖、岩藻糖、半乳糖、甘露糖和唾液酸等，各种类型的糖链结构均发挥重要的调控功能，参与蛋白质的折叠、定位以及细胞-细胞间的相互作用等生物学过程[9]。O-糖基化主要存在于黏液蛋白、免疫球蛋白等分子中，与N-糖基化相比，O-糖基化结构更复杂且组成多变，O-糖基化由糖链与蛋白质丝氨酸或苏氨酸残基以共价形成结合，广泛参与基因转录、细胞周期的调控、细胞代谢及蛋白质降解等生物学过程[5]。

2 蛋白质糖基化与肺癌

蛋白质糖基化可通过调控新生肽链的空间结构、定位及稳定性，参与细胞信号转导、细胞识别与黏附、受体活化等生物学过程。N-糖基化、O-糖基化修饰是恶性肿瘤的普遍特征，在肿瘤细胞中，糖基转移酶表达改变也可调控聚糖结构，导致蛋白质糖基化修饰异常[10]。与正常细胞相比，肿瘤细胞可出现糖基化密度增加、异常O-糖基化及其分支形成、唾液酸水平升高等多种异常糖基化类型[11]。异常的糖基化修饰可导致信号转导、受体配体结合、分子黏附等生物学功能异常，在肿瘤的增殖、侵袭、转移、凋亡、多重耐药、免疫逃逸中起重要作用，并最终导致肺癌患者预后不良[12]。有证据表明，异常的糖基化修饰与肺癌的发生、发展及转移均密切相关[13]。

2.1N-糖基化 N-糖基化修饰在肺癌发生发展的不同阶段均有特征性表达。在早期肺腺癌组织中即发现了N-糖基化产物的特征性表达，与正常肺组织相比，早期肺腺癌组织中存在29种糖基化复合物的差异性表达，而糖基化复合物可部分反映肿瘤微环境变化[14]。同时，在肺癌的不同病理类型中N-糖基化也有差异性表达，参与N-糖基化的糖基转移酶主要包括N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(N-acetylglucosaminyltransferase，GnT)-Ⅴ和GnT-Ⅲ。正常肺组织可表达GnT-Ⅴ，而在约50%的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者中存在GnT-Ⅴ表达减少或缺失[15]。在非鳞状细胞癌中GnT-Ⅴ低表达更常见，且与患者较短的生存期相关，是非鳞状细胞癌Ⅰ期切除患者的不利预后因素[16]。同时，GnT-Ⅲ和GnT-Ⅴ也与上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)密切相关，影响肿瘤的侵袭和转移。GnT-Ⅲ是肿瘤相关EMT的抑制因子，主要修饰上皮钙黏素(E-cadherin)并抑制β联蛋白向胞核转位。GnT-Ⅲ表达缺失可影响E-cadherin的糖基化修饰，导致E-cadherin在上皮细胞的定位异变，从而促进EMT的发生[17]。GnT-Ⅴ糖基化主要参与CD147调控的肿瘤相关EMT，对肿瘤相关EMT具有双重调控作用。在肺腺癌A549细胞株中，GnT-Ⅴ过表达可通过下调转化生长因子-β/Smad信号通路及其下游转录因子的表达抑制肺腺癌A549细胞的EMT过程，延缓肺癌的转移和侵袭[18]。

2.2O-糖基化 O-糖基化修饰与肿瘤细胞的突变密切相关。人肺鳞癌组织中的蛋白质O-糖基化水平显著高于邻近的正常组织，从而促进肺癌细胞的恶性转化[19]。Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因(Kirsten rat sarcoma viral oncogene，KRAS)是肺癌的驱动基因之一。研究表明，O-糖基化修饰可抑制KRASG120基因诱导的衰老过程，加速肺癌的发生，而O-糖基化缺失可延缓肺癌的发生[20]。

此外，O-糖基化水平升高还可促进肺癌细胞的增殖及迁移，协助肿瘤细胞逃避机体监视，导致肿瘤转移及免疫逃逸[21]。沉默O-乙酰氨基葡萄糖转移酶可导致蛋白质O-糖基化水平降低，显著降低肺癌A549细胞株软琼脂集落形成能力和体外侵袭能力[22]。同时，糖基化在细胞免疫和体液免疫中也具有重要作用。β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶1失活可导致T细胞O-聚糖类型发生转变，诱导CD8+T细胞凋亡或记忆性T细胞形成，从而影响细胞毒性T细胞的杀伤作用及细胞免疫反应[23]。此外，蛋白质的O-糖基化还与癌基因及抑癌基因的表达密切相关。抑癌基因p53第149位丝氨酸发生O-糖基化修饰，可导致泛素蛋白连接酶减少，进而抑制p53的降解，同时增强p53的稳定性并使其大量聚集，从而起到抑制细胞癌变的作用[24]。癌基因c-myc是细胞内重要的转录因子，c-myc第58位苏氨酸残基磷酸化可加速c-myc降解，而c-myc第58位苏氨酸O-糖基化可阻止氨基酸残基磷酸化，导致c-myc的稳定性增强，进而导致肿瘤的恶性转化增加[25]。

2.3岩藻糖基化 岩藻糖基化是糖蛋白、糖脂寡糖修饰中最常见的修饰方式，由岩藻糖基转移酶催化，主要参与ABO血型H抗原、Lewis血型抗原形成以及选择素介导的白细胞外渗或淋巴细胞归巢、病原宿主相互作用、信号转导通路的修饰等[26]。

目前已知的人类岩藻糖基转移酶有13种类型，其中岩藻糖基转移酶1～11存在于高尔基体中并催化N-岩藻糖基化，蛋白氧岩藻糖转移酶1/2则定位于内质网中并催化O-岩藻糖基化[27]。岩藻糖基化在不同肿瘤组织、同一组织不同病理类型中均存在较大差异[28]。哺乳动物中，核心岩藻糖基化是N-岩藻糖基化的主要类型，而岩藻糖基转移酶8是负责核心岩藻糖基化的唯一酶[29]。在Ⅰ期NSCLC患者肿瘤组织中岩藻糖基转移酶8的表达水平升高，而沉默岩藻糖基转移酶8可抑制肿瘤的生长、转移，且不影响正常肺上皮细胞的增殖，表明岩藻糖基转移酶8高表达与肺癌恶化和患者的不良预后相关[30]。同时，岩藻糖基化还参与肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移过程。高表达的岩藻糖基化与肿瘤细胞的侵袭性相关，与CL1-0细胞系相比，岩藻糖基转移酶8在肺腺癌CL1-5细胞系中的表达水平显著升高，提示CL1-5细胞系具有较高的侵袭能力[31]。除岩藻糖基转移酶8外，岩藻糖基转移酶7和岩藻糖基转移酶4也参与了肺癌细胞的侵袭和转移过程。有学者通过质粒转染法使肺癌A549细胞中过表达岩藻糖基转移酶7基因，结果发现，A549细胞的侵袭能力显著增强，且肺癌细胞中神经钙黏素、波形蛋白的表达均上调，而E-cadherin表达下调，表明岩藻糖基转移酶过表达可诱导A549细胞发生EMT[32]。沉默肺癌A549细胞岩藻糖基转移酶4表达后，岩藻糖基化及路易斯寡糖-Y抗原水平均显著降低，下调的岩藻糖基转移酶4通过抑制促分裂原活化的蛋白激酶信号通路的激活从而抑制肺癌细胞的转移、侵袭和EMT过程[33]。

3 糖基化在肺癌诊疗中的临床应用

3.1糖基化在肺癌早期诊断中的应用 血清肿瘤标志物是目前临床筛查早期肺癌的常用方法之一，但由于不同的肺癌病理类型会影响肿瘤标志物的表达，同时肿瘤标志物在不同个体中表达的差异也较大，因此血清肿瘤标志物在肺癌检测中存在一定局限[34]。而糖基化标志物的检测为肺癌的诊断提供了新思路，可能是肺癌早期诊断潜在的生物学标志物之一。

有研究运用凝集素微阵列法分析NSCLC患者与健康人群的N-聚糖谱和O-聚糖谱，结果发现，NSCLC患者疾病早期凝集素、加纳籽凝集素-Ⅰ、双花扁豆凝集素等10多种凝集素与健康人群存在显著差异[35]。焦丽静等[36]采用DNA测序仪荧光电泳技术检测肺癌患者血清发现，N-糖组图谱具有特征性表达：与健康对照者相比，肺癌患者N-糖组图谱Peak1、Peak5、Peak9升高，而Peak3、Peak6、Peak11降低；与良性肺病患者相比，肺癌患者N-糖组图谱Peak5、Peak9升高，Peak3、Peak4、Peak11降低；且N-糖组图谱Peak1、Peak5、Peak9、Peak10、Peak11与肺癌TNM分期呈正相关；Peak3、Peak4、Peak6、Peak7、Peak8与肺癌TNM分期呈负相关。Chen等[37]通过检测疾病特异性触珠蛋白β链N-糖基化发现，Asn207/211位点的糖肽水平比例具有潜在区分良性肺部疾病与NSCLC的能力，其灵敏度为74.4%、特异度为82.8%。Tn抗原是O-糖基化常见的前体之一，Tn抗原可接受一个半乳糖单位形成T抗原，广泛参与肿瘤细胞黏附与组织侵袭[38]。研究发现，肺腺癌患者的T/Tn抗原结合物木菠萝凝集素、加纳籽凝集素-Ⅰ、双花扁豆凝集素水平均显著升高，而肺鳞癌患者的木菠萝凝集素、双花扁豆凝集素水平均显著降低，因此T/Tn抗原可作为区分NSCLC组织学亚型的潜在标志物[35]。

异常糖链糖蛋白(tumor abnormal protein，TAP)是肿瘤细胞增殖过程中的共同特征，与肿瘤密切相关。TAP检测具有简便、广谱、高效的特点，对于肿瘤的筛查具有重要意义。研究表明，TAP检测可作为肺癌早期诊断、病情分期较好的指标[39]。肺癌患者的TAP水平显著高于健康人群，其检测肺癌患者的灵敏度为83.25%、特异度为34.91%，且与血清CEA、NSE、CYFRA211相比，TAP的灵敏度显著升高[3]。刘丽燕等[40]研究发现，在NSCLC患者中TAP阳性率高达86.67%，而在健康人群中TAP阳性率仅为3.33%，且Ⅰ～Ⅱ期NSCLC患者的TAP凝聚物面积小于Ⅲ～Ⅳ期NSCLC患者。此外，肺癌患者的TAP与传统肿瘤标志物也具有相关性，对肺癌的诊断也具有一定的参考价值。肺癌患者血清CEA、CA125水平随TAP增高而增高，同时不同病理类型的肺癌患者TAP亦与肿瘤标志物具有相关性，其中肺腺癌、鳞癌患者的TAP与CEA、CA125呈正相关，小细胞癌及未分类癌患者的TAP与CA125水平呈正相关[41]。TAP联合肺癌传统血清肿瘤标志物(CEA、NSE、CYFRA211)检测，受试者工作特征曲线下面积显著大于单纯血清标志物检测；同时，在CT检测阳性(CT报告提示肺癌可能)的患者中，TAP检测的特异度为40.0%，灵敏度为79.17%[3]。TAP、热激蛋白90α以及肿瘤标志物(CEA、NSE、CYFRA211)联合检测小细胞肺癌，其受试者工作特征曲线下面积为0.901，检测的灵敏度为92.00%、特异度为75.81%[42]。提示TAP联合传统血清肿瘤标志物及CT检测可提高肺癌的诊断率。因此，TAP联合肿瘤标志物等多参数检测可弥补单一检测手段的不足，提高肺癌诊断的准确率。

3.2糖基化在肺癌疗效及预后评估中的应用 检测TAP水平的变化对肺癌疗效及预后评估均具有一定意义。TAP阴性提示肿瘤可能根除；TAP阴性或弱阳性，但在1个月后再次表达为阳性则提示肿瘤残留或肿瘤转移；TAP阴性1年后再次表达为阳性则提示肿瘤复发或转移[43]。任占良等[43]发现，肺癌根治术联合辅助化疗治疗后1个月、3个月，患者 TAP表达阳性率均较治疗前显著降低，而行单纯化疗治疗前后患者的TAP表达阳性率无明显变化。接受肺癌根治术联合辅助化疗治疗2周后，Ⅰ～Ⅱ期NSCLC患者TAP凝聚物面积即开始减小，治疗3个月后TAP凝聚物面积较治疗前减少了79%；Ⅲ～Ⅳ期NSCLC患者TAP凝聚物的面积亦有所减少，其降低幅度为63%[40]。史英等[44]发现，TAP表达水平与肺癌患者TNM分期相关，TNM分期越晚，TAP表达水平越高；化疗后再次检测患者的TAP，发现部分缓解者的TAP水平较治疗前显著降低，而进展者的TAP水平较治疗前显著升高，稳定者的TAP水平则无显著变化，提示TAP水平的动态变化对肺癌患者疗效评估有一定的预测价值。

目前关于肺癌患者预后的判断尚无统一标准，传统的TNM分期在肺癌患者的预后评估中具有重要作用，但仍存在局限性。研究表明，NSCLC患者的TAP面积与生存时间呈负相关[45]。TAP阳性的肺癌患者3年生存率显著低于TAP阴性患者，同时TAP阳性患者的淋巴结转移率也显著高于TAP阴性患者[46]。黄婷婷等[47]发现，肺癌合并胸腔积液及远处转移者的TAP水平显著高于未合并者。因此，TAP水平在肺癌预后评估中也具有一定价值。

3.3糖基化修饰在肺靶向药物传递系统中的应用 提高药物在病变部位的浓度、最大限度地降低药物的不良反应发生率是目前恶性肿瘤治疗过程中亟须解决的问题。肿瘤细胞高表达葡萄糖转运蛋白1，而葡萄糖转运蛋白1可与无毒、无免疫原性、生物相容性以及降解度良好的相应糖基配体(甘露糖、半乳糖、葡萄糖等)产生特异性识别。糖基化药物传递系统通过将抗肿瘤药物定向转运至靶区而发挥药效，在肿瘤靶向治疗中起重要作用[48]。肺癌细胞表面的葡萄糖转运蛋白1与肺组织巨噬细胞表达的甘露糖受体产生特异性识别，通过内吞或转运作用将携带特殊糖配体的药物传递系统靶向传送至肺部，减少药物在其他脏器的分布，提高药物的治疗指数、减少不良反应发生[49]。有学者通过制备羟喜树碱糖基化脂质体并注射给小鼠发现，脂质体主要被小鼠肺摄取，且与普通注射剂相比，羟喜树碱在小鼠肺部停留的时间显著延长，相对摄取率为60.72，肺靶向效率为17.57[50]。另外，经糖基化修饰的吉非替尼包合物脂质体在小鼠肺部聚集，导致小鼠肺部的药物浓度显著升高[51]。有研究将甘露糖结合的pH敏感靶向递送吉非替尼纳米载体系统运用于肺癌A549裸鼠异种移植模型，给药后发现，裸鼠肿瘤组织内吉非替尼浓度显著升高，与吉非替尼原料药相比，应用该系统后吉非替尼药物累积量升高了7倍，表明甘露糖结合的pH敏感靶向递送吉非替尼纳米载体系统对A549细胞有显著抑制作用[52]。

4 小 结

“精准医疗”模式为肺癌患者带来了更多的治疗选择，但目前临床仍缺乏肺癌早期筛查、识别以及预后判断的有效手段。异常的蛋白质糖基化修饰广泛存在于肺癌发生、发展和转移过程中，与肺癌的病理类型、病情分期等密切相关。而糖链检测具有创伤性小、检测周期短、可重复等优点，因此在肺癌早期诊断、治疗、预后评估等方面具有潜在的临床应用价值。另外，基于糖基化修饰的肺靶向药物传递系统在肺癌的治疗中也具有巨大潜力。但目前糖链检测在肺癌中的应用尚缺乏大样本的临床数据，且缺乏统一的定量标准，因此仍存在局限性。未来随着糖组学检测技术的发展，可以更深入了解异常糖基化类型与肺癌的关系，并将糖组学检测技术真正用于肺癌的临床诊疗过程中。