不同源性外泌体在糖尿病足溃疡修复中作用的研究进展

梁结梅 孙铁辉 向鹏安 张伟 徐 姗

（1.河北北方学院研究生院，河北 张家口075051；2.中国人民解放军94498部队医院，河南 南阳 474300 3.空军特色医学中心老年医学科，北京 100142）

糖尿病是一种慢性代谢性疾病，影响着全身多个系统，其患病率逐年上升[1]。糖尿病足是糖尿病最严重的并发症之一，可导致足部出现感染、溃疡和组织破坏，严重危害患者的身心健康，加重家庭及社会的负担。糖尿病足溃疡（diabetic foot ulcers，DFU）是糖尿病的严重并发症,具有治疗费用高，治疗时间长、难度大，复发率高和预后差等特点，目前临床治疗存在一定的难度。近年来，外泌体（exosomes，Exos）作为无细胞治疗慢性溃疡的新兴方法成为创面修复及再生医学的研究热点。Exos广泛存在于各种活细胞及体液中，具有特异的功能性、靶向性和驱动机制，在细胞通讯中起着重要作用。研究表明，Exos具有调节免疫反应，修复和替换细胞，调节炎症反应，促进肉芽组织形成、血管生成、伤口再上皮化，促进皮肤创面愈合和减少瘢痕形成等作用。本文对不同来源的Exos在DFU修复中潜在的作用综述如下，以期为DFU的临床治疗提供新思路。

1 Exos的生物学特征及功能

1.1 Exos的生物学特征 Exos来自内吞膜，是直径为30～150 nm的细胞外囊泡亚型，内含蛋白质、脂类、RNA和DNA等生物分子[2]，广泛存在于各种体液，如血液、精液、唾液、血浆、尿液、脑脊液、附睾液、羊水、恶性胸腹腔积液、支气管肺泡灌洗液和母乳等[3-4]。目前分离提取方法主要有标准超速离心、蔗糖梯度离心和聚合物沉淀、微流体过滤、无接触分拣、免疫亲和富集法等[5]。

1.2 Exos的生物学功能 Exos具有旁分泌作用，是细胞间通讯的重要载体，参与多种生理和病理过程，如清除衰老分子[6]、抗原呈递[7]、通过在肿瘤细胞转移过程中促进血管生成和肿瘤细胞迁移参与肿瘤进展[8-9]、抑制免疫反应[10]、通过与受体细胞相互作用传播疾病等[11]。研究显示，Exos主要通过减轻炎症反应、诱导血管生成以及促进成纤维细胞和角质形成细胞的生长等机制加速慢性创面的愈合[12]，并且在免疫反应、细胞死亡、神经退行性疾病等疾病的病理过程中发挥着重要作用[13]。

2 不同源性Exos在DFU修复中的潜在应用价值

目前用于研究的治疗慢性创面的外泌体衍生来源主要有间充质干细胞（MSCs）、内皮祖细胞（EPCs）、富血小板血浆（PRP）、人尿源干细胞（USCs）、巨噬细胞、唾液、表皮干细胞（EPSCs）、人羊水来源干细胞（hAFSCs）、自体真皮成纤维细胞（DFs）和人脐带血浆（UCBs）等。其中MSCs来源又包括脂肪间充质干细胞（ADSCs）、骨髓间充质干细胞（BMSCs）、脐带血间充质干细胞（UCMSCs）、胎盘间充质干细胞（PMSCs）和人经血来源间充质干细胞（MenSCs）。

2.1 MSCs源性Exos MSCs是具有自我更新、多向分化潜能的多能干细胞，来源于骨髓、脂肪组织、脐带、羊水和胎盘等多种组织[14]，其在维持组织稳态和伤口愈合方面的作用已经得到证实。MSCs促进组织修复和再生的机制是产生大量抗炎细胞因子和大量Exos，抑制炎症和调节靶细胞功能[15]，并且，MSCs分泌的关键产物Exos具有类似亲代MSCs的作用[16]。鉴于MSCs衍生的Exos所具有的独特的创面修复功能，其在创面修复中被认为是有应用前景的治疗方法[17]。

2.1.1 ADSCs源性Exos 脂肪组织广泛分布于人体中，并可通过微创手术大量获取。与ADSCs相比，ADSCs源性Exos免疫原性低、稳定性更高且易于储存，在再生医学中有着广阔的应用前景。在创面修复中，ADSCs源性Exos能调节免疫和炎症反应、促进血管生成、加速皮肤细胞的增殖和再上皮化，并抑制导致瘢痕增生的胶原重塑，还可以作为载体和组合支架进行创面治疗，从而实现无瘢痕皮肤修复[18]。在ADSCs源性Exos刺激下，成纤维细胞中I型胶原蛋白、III型胶原蛋白、基质金属蛋白酶1（MMP1）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和转化生长因子-β1（TGF-β1）的mRNA和蛋白水平均增加；此外，Exos通过磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信号通路优化胶原沉积[19]，显著加速了体内实验中伤口的愈合。ADSCs源性Exos含有可抑制NPM1、PDCD4、CCL5和NUP62等基因的微小RNA（miRNA），通过刺激真皮成纤维细胞的增殖，促进皮肤成纤维细胞的再生[20]。Cooper等[21]将ADSCs源性Exos应用于人真皮成纤维细胞(HDF)，结果表明，Exos含有长链非编码RNA（lncRNA）MALAT1和其他可能刺激HDF迁移和血管生成的因子，从而促进创面愈合。另有研究初步确定Wnt/β-catenin信号通路为ADSCs源性Exos在细胞增殖和迁移中起促进作用、在细胞凋亡中起抑制作用的潜在机制[22]。Li等[23]发现，ADSCs源性Exos在高糖环境中促进了EPCs的增殖和血管生成，使用过表达核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2 ，Nrf2)的 ADSCs源性Exos治疗糖尿病大鼠模型足部创面，可观察到溃疡面积明显缩小，并可在创面中检测到肉芽组织和血管的生成，及生长因子表达水平增加，而炎症、氧化应激相关蛋白水平降低。ADSCs源性Exos可以将微小RNA-125a(miR-125a)转移到内皮细胞并通过抑制DLL4（delta-like 4)促进血管生成[24]，而过表达长链非编码RNA linc00511的ADSCs源性Exos则通过抑制PAQR3基因诱导的Twist1泛素降解[25]加速血管生成，从而促进DFU等慢性溃疡愈合。Shen等[26]证实, ADSCs源性Exos可以通过调节巨噬细胞炎症反应来减弱损伤后的早期肌腱炎症反应。 Bucan等[27]在ADSCs源性Exos中发现了神经生长因子转录本的存在，其在体外实验中可增加神经突的生长，在体内实验中可促进坐骨神经损伤后的再生。ADSCs源性Exos移植作为一种新颖的无细胞疗法，具有调节炎症、促进血管生成和皮肤创面愈合的作用，还能减轻肌腱炎及促进神经再生，并且易于获取、存储方便、免疫原性低，在DFU的临床治疗中具有较好的应用前景。

2.1.2 BMSCs源性Exos BMSCs不仅能够分化形成骨、软骨、脂肪、神经及成肌细胞等，而且有分泌多种生长因子的能力，在骨组织工程和再生医学应用中备受关注。DFU除了涉及皮肤、肌肉、肌腱等软组织的损伤外，还会对骨、软骨和关节等造成破坏，增加了治疗难度。研究显示，携带miR-122-5p的BMSCs源性Exos能促进骨坏死兔模型的成骨细胞增殖[28]。体内实验表明，使用过度表达miR-122-5p的Exos，骨矿物质密度、小梁骨体积和股骨头的平均小梁板厚度均增加，并观察到坏死股骨头组织的再生。Takeuchi等[29]将BMSCs源性Exos应用于颅盖骨缺损的大鼠模型，结果表明，BMSCs源性Exos通过增强血管生成在骨再生中发挥重要作用。有研究表明，局部施用BMSC源性Exos能有效促进纤维软骨的形成，进一步研究发现，其主要机制是通过增加腱骨愈合过程中的M2巨噬细胞极化[30]。另外，Ding等[31]在链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠模型全层皮肤伤口中应用去铁胺刺激的BMSCs源性Exos，经过为期14 d的观察，与对照组相比，BMSCs源性Exos治疗组表现出伤口闭合速度更快、闭合率更高，并且促进生成新生血管和胶原纤维，愈合后的瘢痕更小。BMSCs源性Exos通过抑制TGF-β/Smad信号通路，有效促进HaCaT和HDF两种类型的皮肤细胞增殖，从而促进大鼠皮肤伤口皮肤愈合[32]。这些发现为 BMSC源性Exos 在皮肤、肌腱和骨修复中的潜在临床应用提供了基础，相信未来通过对其机制的深入研究，有望成为治疗DFU和骨髓炎的新疗法。

2.1.3 UCMSCs源性Exos UCMSCs源性Exos在促进创面愈合方面具有与UCMSCs相似的功能，均能加速伤口闭合，减少瘢痕形成，改善皮肤附属器、神经和血管的再生，并调节胶原纤维在伤口愈合中的自然分布[33]。在严重烧伤大鼠模型中，巨噬细胞的炎症反应明显，炎性因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-1β（IL-1β）的表达显著增加，IL-10水平降低。UCMSCs源性Exos中的miR-181c在调节炎症中起关键作用[34]。动物实验显示，将UCMSCs源性Exos直接注射到小鼠的全层皮肤缺损中，可显著加快皮肤伤口愈合[35]。UCMSCs源性Exos通过增强表皮再上皮化和真皮血管生成，起到减轻全层皮肤损伤的作用。 Liu等[36]研究证实，UCMSCs源性Exos通过递送血管生成素-2（angiopoietin-2，Ang-2）促进血管生成来加速皮肤伤口愈合。此外，UCMSCs源性Exos还通过miR-21-5p和miR-125b-5p介导TGF-β受体抑制肌成纤维细胞和胶原蛋白I的过度形成，并增加体内和体外皮肤细胞的增殖和迁移[37]。虽然UCMSCs源性Exos被证实在皮肤创面修复中具有调节炎症、促进皮肤愈合的积极作用，但用于DFU的临床治疗还有待进一步研究。

2.1.4 胎盘干细胞（PMSCs）源性Exos 人足月胎盘组织MSCs (PlaMSCs)是PMSCs常见来源，含有血管生成和血管抑制因子，可增强内皮血管的形成。PlaMSCs衍生的Exos被整合到内皮细胞中，刺激了内皮血管的形成和迁移，并增强了血管生成相关基因的表达[38]。Zhao等[39]在小鼠伤口愈合实验中发现，人羊膜上皮细胞衍生的Exos可被成纤维细胞内化，从而刺激细胞迁移和增殖。将过表达miR-135a的人羊膜间充质干细胞来源Exos直接注射到伤口边缘，可使伤口愈合速度更显著[40]。这些研究揭示了PlaMSCs源性Exos在伤口愈合中对促进细胞增殖和血管生成起到了积极作用，但目前缺乏相关机制的深入研究，未来的研究尤其是临床前期研究应侧重机制方面的研究，将其开发成为慢性创面治疗的新手段。

2.1.5 MenSCs源性Exos MenSCs是一种因非侵入性而易获取、来源丰富的MSCs，具有较BMSCs更高的增殖能力。研究表明，MenSCs 源性Exos可通过诱导M1-M2巨噬细胞极化从而减轻创面炎症，上调血管内皮生长因子A从而促进新血管生成，上调核因子-κB（NF-κB）的p65亚基和激活NF-κB信号通路而加速上皮化，并通过降低I型胶原蛋白∶III型胶原蛋白的比率来减少瘢痕形成[41]。MenSCs 源性Exos有效地减轻了创面炎症反应，促进了创面的血管生成，促进创面愈合，作为可通过无创方式获取的MSCs源性Exos，在再生医学如DFU修复等难治性创面的应用中有着特殊意义。

2.2 EPCs源性Exos EPCs 是内皮细胞的前体，可通过促进新生血管生成的方式促进糖尿病溃疡创面的修复。Zhang等[42]在动物实验中发现，EPCs源性Exos具有促进血管生成和创面愈合的功能；他们在糖尿病大鼠背部建立全层皮肤缺损创面并局部注射EPCs源性Exos，结果显示，与对照组相比，治疗组的伤口有大量胶原蛋白沉积，形成的瘢痕更小，并且随着Exos浓度的增加，伤口区域的再上皮化程度高，胶原蛋白更成熟，而且瘢痕的形成更少，并且在EPCs源性Exos处理的创面观察到大量新生血管形成，且血管数量随着Exos浓度的增加而增加，其主要机制可能是EPCs源性Exos通过Erk1/2信号转导促进血管生成，从而促进皮肤伤口修复和组织再生。Hu等[43]证实了miR-21-5p在EPCs源性Exos中具有高度富集的特征，且特异性抑制内皮细胞内的血管生成和血小板反应蛋白-1（THBS1）的表达，以促进内皮细胞的修复。另外, miRNA-221-3p也是EPCs源性Exos中高表达的miRNA之一，可促进糖尿病小鼠的皮肤伤口愈合[44]。这些研究证实了EPCs源性Exos能有效的促进创面修复，并且揭示了其在慢性创面修复中的分子机制，为DFU的临床治疗提供了一种潜在的新方法，但是对于其最佳的有效治疗剂量的研究尚属空白，未来可针对此进行更深入的探索研究。

2.3 PRP源性Exos PRP内血小板分泌的生长因子含量丰富，在临床上广泛应用于慢性创面的治疗，而PRP源性Exos可以封装血小板中的主要生长因子，这一特性为其在创面修复中的应用奠定了基础。Guo等[45]证明PRP源性Exos可发挥与PRP相似的创面修复功能。他们在糖尿病大鼠背部建立全层皮肤创面，并随机分为对照组、海藻酸钠水凝胶组、PRP凝胶组和PRP源性Exos凝胶组，给予相应治疗，14 d后观察到PRP源性Exos 治疗组的伤口几乎闭合。PRP源性Exos促进人微血管内皮细胞株HMEC-1细胞和成纤维细胞增殖、迁移的能力较PRP更显著，其主要机制可能是Exos通过激活细胞外调节蛋白激酶（Erk）、Akt信号通路，增强了PRP诱导的血管生成能力；还能有效地促进体外HaCaT细胞的增殖、迁移，促进创面愈合[46]，其可能的机制是泛素特异性蛋白酶15通过促进真核翻译起始因子4A1泛素化，从而增强了HaCaT细胞增殖和迁移的功能特性。 这些研究为PRP对慢性溃疡愈合影响的潜在分子机制提供了有力佐证，并提出PRP源性Exos有望成为治疗DFU不受物种限制的Exos生长因子资源，未来需要更多的临床前期及临床研究来探索其疗效及最佳治疗剂量。

2.4 USCs源性Exos USCs具有与MSCs相似的生物学特性，如细胞表面标志物表达谱、自我更新能力、多向分化、促血管生成旁分泌作用和免疫调节等。Chen等[47]在3名24～28 岁的健康捐赠者尿液样本中分离出USCs源性Exos，局部皮下注射于糖尿病小鼠背部的两个皮肤创面，发现USCs源性Exos能有效增强角质形成细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞等创面愈合相关细胞的增殖和迁移，对血管生成也有一定的促进作用。其功能分析发现，USCs源性Exos主要通过DMBT1蛋白诱导内皮细胞的血管生成反应，并促进血管生成和伤口愈合。USCs源性Exos能通过无创方式大量获取，为DFU治疗提供了又一新方向。

2.5 巨噬细胞衍生的Exos 有报道，在动物实验中，巨噬细胞来源的Exos可减轻小鼠炎症性疼痛模型中的热痛觉过敏，在调节炎症中发挥积极作用；此外，它们具有的免疫保护作用也受到关注[48]。Li等[49]证实了巨噬细胞衍生Exos通过抑制促炎酶和细胞因子的分泌发挥抗炎作用，并通过诱导内皮细胞增殖和迁移来促进糖尿病伤口的血管生成和再上皮化，从而实现加速伤口愈合的效果。巨噬细胞来源Exos具有强大的抗炎潜力，有望成为创面修复尤其是慢性感染性创面修复的有效治疗方法，但机制还有待进一步研究。

2.6 唾液源性Exos 唾液中含有大量蛋白质和生长因子，可以加速伤口愈合，但其机制仍不清楚。Mi等[50]证实，唾液源性Exos在体外实验中可诱导人脐静脉内皮细胞增殖、迁移和血管生成，而在体内实验中则表现出强大的促进皮肤伤口愈合能力。泛素结合酶E2O (UBE2O)是唾液Exos的主要mRNA之一，在体内、外实验中，UBE2O的激活均表现出与唾液Exos相似的作用。研究者认为其主要机制为UBE2O通过降低SMAD同源物6 (SMAD6)的水平，激活骨形态发生蛋白2 (BMP2)，进而诱导血管生成。尽管唾液源性Exos代表了一种通过促进血管生成来促进创面修复的新策略，但要实现临床应用，还需要深入研究。

2.7 EPSCs源性Exos EPSCs是一类具有无限增殖能力、可增殖分化为表皮中各种功能细胞的细胞群。Duan等[51]在皮肤缺损大鼠模型中研究了EPSCs源性Exos对皮肤伤口愈合的治疗作用，发现EPSCs源性Exos显著提高了大鼠的伤口愈合率，减少了瘢痕形成，并有效促进了皮肤附属器、神经和血管的再生水平以及胶原蛋白的自然分布。此外，EPSCs源性Exos中富集了特定的 miRNA，包括miR-16、let-7a、miR-425-5p 和 miR-142-3p，这些特异性RNA通过降低真皮成纤维细胞中TGF-β1的表达，抑制肌成纤维细胞分化，从而减少瘢痕形成。EPSCs源性Exos在创面修复中能有效增加伤口愈合率、抑制瘢痕形成，未来有望用于DFU等慢性创面治疗的无细胞疗法中。

2.8 hAFSCs 源性Exos hAFSCs是胎儿间充质祖细胞，具有独特的心脏保护和促进血管生成特征。Balbi等[52]报道hAFSCs能主动释放具有显著旁分泌潜力和再生作用的细胞外囊泡。这些囊泡具有诱导增殖、免疫调节和促进血管生成的能力，在骨骼肌萎缩模型中也表现出强大的再生潜力。据报道，hAFSCs源性 Exos包含let-7-5p、miR-22-3p、miR-27a-3p、miR-21-5p和 miR-23a-3p等miRNA，这些miRNA通过靶向TGF-β受体I型和TGF-β受体II型，抑制TGF-β信号通路的表达，从而加速创面愈合速度，并改善了毛囊、神经和血管的再生，还在创面愈合过程中促进了皮肤细胞的增殖和胶原蛋白的自然分布[53]。hAFSCs源性 Exos可能代表了一种在创面愈合过程中抑制纤维化瘢痕形成的无细胞治疗工具，有望成为慢性创面的皮肤、神经和血管修复的新型无细胞疗法。

2.9 DFs源性Exos DFs在皮肤再生和修复方面显示出巨大的潜力。 Han等[54]发现，DFs源性Exos可以在体外逆转高糖对人脐静脉内皮细胞产生的损伤；研究者发现，在2型糖尿病大鼠模型创面局部皮下注射DFs源性Exos，可显著促进创面的上皮再生、胶原沉积、皮肤细胞增殖和血管生成，并且有效地抑制炎症，加速糖尿病皮肤创面愈合；其主要机制可能是DFs源性Exos激活了Akt/β-catenin通路。DFs源性Exos在创面愈合中发挥积极作用，尤其是其逆转内皮细胞损伤的特性，颇受研究者的关注，但其潜在机制和在DFU临床应用上仍需要更多的研究支持。

2.10 UCBs源性Exos 干细胞移植是近年创面修复的研究热点。人脐带血具有易获取、低免疫原性及对供体无害等特点，是理想的干细胞来源。UCBs含有丰富的Exos，可稳定分离并安全储存，并具有类似干细胞的促再生能力。Hu等[55]在体外实验中发现，miR-21-3p 在 UCBs源性Exos 中高度富集，并通过抑制同源性磷酸酶-张力蛋白(PTEN) 和侧枝发芽因子同源物 1 (SPRY1) ， 促进成纤维细胞的增殖和迁移，增强内皮细胞的血管生成活性。Kim等[56]使用人成纤维细胞进行划痕伤口分析时发现 ，UCBs源性Exos通过促进M2巨噬细胞的血管生成和分化，减轻伤口的炎症反应，促进组织增殖，表现出比成人血浆外泌体 (ABP-Exos) 更好的伤口愈合效果。UCBs源性Exos作为一种非常具有前景的Exos来源，具有减轻炎症、促进血管生成和组织增殖的功能，有望成为创面修复的临床新疗法，但是其在DFU的应用有待更深入的研究。

3 总结与展望

Exos在急、慢性创面修复的各个阶段都产生了积极作用，包括调节免疫反应、减轻炎症、促进细胞增殖和血管生成，同时还能减少伤口愈合过程中的瘢痕形成，另外在肌腱和骨愈合中也有一定促进作用。更重要的是Exos不具有免疫原性，也没有物种差异，信号可以跨物种传递[57]，因此有望从其他物种大量获取，批量生产并作为无细胞疗法用于临床。然而，Exos的临床应用仍面临巨大的挑战，包括提取方法的简化、纯度、变异性、最佳的来源及永生化、标准化的生产和分离程序以及最佳剂量和给药途径等[58-60]，如何实现商业化大批量生产也是亟需解决的问题。目前大部分Exos的临床前期研究主要针对一般性皮肤伤口，应用在糖尿病和DFU动物模型上的研究有限，而且截至目前为止还没有针对DFU的Exos治疗的临床试验，更重要的是关于其治疗的不良反应鲜有报道，要克服从实验室到临床使用的障碍，需要完善包括临床前期及临床试验在内的研究来探索Exos的治疗作用和机制，并找到可行的临床实践方案。