活性氧对胚胎发育的影响

李晓娜，张振刚，马学工，李斌业

（青海省人民医院生殖中心，青海 西宁 810007）

不孕不育症已日渐成为影响健康的普遍性问题，且发达国家及发展中国家不孕不育症患病率均持续上升，其与性传播疾病增加、肥胖、婚育年龄延迟等因素密切相关。辅助生殖技术（assisted reproductive technology，ART）日渐成熟，现已成为治疗不孕不育的主要方法。影响体外胚胎质量的因素如遗传因素、胚胎环境（pH、渗透压、温度以及气体组成等）、卵母细胞体外成熟（in vitro maturation，IVM）等，可能导致胚胎细胞核与细胞质发育不平衡，最终影响胚胎质量、移植率以及妊娠率等[1-3]。活性氧（reactive oxygen species,ROS）是细胞代谢的正常产物，但是过度的ROS 则会对细胞产生损伤，如DNA损伤、线粒体功能障碍、脂质过氧化的蛋白质氧化修饰等，从而使卵母细胞细胞恶化，最终影响其正常发育[4，5]。卵母细胞在生长过程中会产生ROS，而体外培养的过程中会有很多人为因素的干预，如灯光、机械处理、空气等都会产生额外的ROS。研究发现[4]，与体内成熟卵母细胞相比，体外培养卵母细胞更容易受到氧化应激反应的影响。此外，姜薇等[6]研究表明，抗氧化剂可以与氧自由基结合，可抑制自由基链的起始增殖，减轻氧化应激损伤，消除ROS 对胚胎造成的影响，进而提高体外培养中卵母细胞的质量。本文就ROS 对胚胎的影响机制及减轻ROS 对胚胎损伤的方法作一综述，以期为提高临床妊娠率提供相关的理论依据。

1 ROS 对胚胎的影响机制

机体在正常生理条件下氧化防御系统处于平衡状态，当机体抗氧化系统不能有效地中和组织和细胞所产生的氧化物时就会产生所谓的氧化应激[7]。研究表明[8]，氧化应激是导致女性不孕不育的重要影响因素，在卵泡生长发育过程中，氧化应激可诱导卵母细胞发生变形甚至凋亡，改变减数分裂纺锤体，引起脂质过氧化、细胞膜的选择性消失，胞质酶失去活性和DNA 损伤。ROS 是一种通过线粒体电子链中有氧代谢产生的氧自由基，它是细胞信号转导、受体激活以及基因表达等机制的重要参与者，适量的ROS 可以维持卵母细胞的正常生理状态，而过量的ROS 会产生氧的毒性代谢离子，如过氧根离子（O2-）和氢氧根离子（OH-），使得卵母细胞膜发生组成发生改变，膜的不稳定性和卵母细胞卵裂异常，引起胚胎发育中正常所需物质发生变化，最终使得胚胎发育停滞甚至死亡[9，10]。ROS 通过不同的信号通路对胚胎发育产生不同的影响，具体机制如下。

1.1 ROS 通过调控p53 因子影响胚胎发育 随着胚胎冷冻技术的不断发展，越来越多的生殖中心会选择冷冻胚胎来找寻患者的最佳移植时期。研究发现[11]，在冻融胚胎过程中，胚胎对ROS 会产生更高的敏感性，而过氧化氢（H2O2）作为ROS 的重要组成部分，与P53 有着很大的联系。

p53 一直作为“基因卫士”被临床知晓，其是细胞周期和细胞凋亡的调控者。机体在一定条件下p53 才会被激活，如机体渗透压发生改变、氧化应激状态以及紫外线照射等。研究发现[12]，在敲除p53 的小鼠模型中，其卵母细胞会出现分裂异常和受精率降低等现象，它可以在胚胎的配子发生有丝分裂时保护遗传的稳定性。井洋洋等[13]研究发现，经过H2O2处理后，胚胎中的p53 基因mRNA 表达量明显高于对照组；GADD45 作为p53 基因大的下游基因，同样经过H2O2干预后，其表达量也明显高于对照组；当添加了抗氧化剂时，结果发现p53 表达量有明显的下降，且伴随着ROS 表达量减少，p53 基因mRNA含量也会出现下降，说明ROS 引起的氧化应激可能会通过影响p53 表达量对胚胎发育进行调控，由此可以进一步推测在胚胎处于氧化应激状态时。同时，p53 也可以通过调控GADD45 等下游基因来修复细胞损伤，保证胚胎染色体稳定性，最终确保胚胎的遗传完整性。此外，当胚胎处于应激状态时，会产生较多的ROS，它能够激活p53 基因，该基因可以通过调控其上游或下游基因的表达量，以此对胚胎细胞周期产生影响[14，15]。

1.2 ROS 通过干预细胞自噬影响胚胎发育 自噬是指从粗面内质网的无核糖体附着区脱落的双层膜包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等成分形成自噬体，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以此实现细胞内物质的再循环[16]。机体在生理或病理情况下，自噬大都会产生作用，其中卵母细胞在生长发育的过程中会产生大量的蛋白质和mRNA，在蛋白质降解过程中，自噬起着尤为重要的作用[17]。研究发现[18]，存在自噬缺陷的胚胎发育不会超过8 细胞，其机制可能是胚胎从4 细胞到8 细胞过程中会进行大量的蛋白质合成，而自噬缺陷的胚胎新和成蛋白的能力就会受到抑制，从而影响胚胎的正常发育。

此外，胚胎在发育的过程中会产生大量的ROS，并且有研究发现[19]，伴随着ROS 表达的增多，自噬标志物LC3-Ⅱ的含量也会升高，说明ROS 与自噬之间存在重要的联系，并且能够诱导自噬的产生，其机制主要有以下几方面：①ROS 可以通过促进细胞核内的染色质相关蛋白HMGB1 向细胞质转运，进而上调细胞自噬水平；②ROS 可以通过激活ClassⅢPI3K/Beclin1 信号通路，抑制mTOR 和Akt信号通路中的相关蛋白的表达量，从而诱导自噬产生；③p53 靶基因编码的蛋白能够诱导凋亡调控因子（TIGAR）间接的减少ROS 的表达量，从而阻碍自噬的发生。由此可以推测，ROS 可以通过多条信号通路对自噬产生影响，但ROS 究竟是如何通过自噬作用对胚胎细胞产生影响还需要更加深入的研究。

1.3 ROS 与胚胎细胞凋亡的关系 细胞凋亡是一种不可避免的生理现象。细胞在发育过程中会发生代谢反应，使得衰老的线粒体过度堆积，随之产生过多的ROS，进而使得氧化应激不断增强，相反的就会损伤细胞线粒体和溶酶体等，激活凋亡途径，最终导致细胞的凋亡[20]。许鹏宇等[21]通过对第3 天废弃胚胎研究发现，人类胚胎的碎片率与ROS 表达量呈正相关性，此外，将胚胎分别置于5%和20%氧气环境下培养后发现，20%氧气环境下ROS 的表达量明显高于5%氧含量环境，由此推测高水平的ROS 可能会造成胚胎造成损伤，阻碍胚胎正常发育[22]。胚胎是由精子和卵母细胞融合而成，精子与卵子之间高效的选择性保证了胚胎的遗传性，因此优质的精子和卵子就显得尤为重要，赵洪鑫等[23]研究发现，试验组患者精浆ROS 水平较对照组明显升高，ROS 水平与精子DFI（DNA 碎片指数）呈正相关，表明不育症男性的精子可发生脂质过氧化反应，导致精子DNA 碎片增加，这就说明了ROS 可引起机体氧化-抗氧化系统的失衡，导致脂质过氧化物损伤，可能与精子细胞膜蛋白质受体和转运蛋白质的结构改变有关。

ROS 也可以通过影响Caspase 凋亡通路对胚胎发育造成影响。Caspase 凋亡通路作为内质网应激凋亡途径中的重要组成部分，ROS 可以通过内外两条途径引起细胞凋亡，过量的ROS 可以导致细胞脂质过氧化，线粒体通透性转化，从而激活Caspase 凋亡通路；外源性途径主要由于一些死亡受体能够直接激活Caspase 凋亡通路，使得细胞发生凋亡[24]。总之，ROS 可以通过影响精子的质量使得胚胎细胞发育停滞甚至凋亡，最终影响胚胎的妊娠率。

2 减轻ROS 对胚胎损伤的方法

2.1 提高操作熟练技术，调整胚胎最适生长环境 辅助生育技术主要是由体外受精胚胎移植技术（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）和胞浆内单精子注射技术（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）组成，从获卵到受精，再到胚胎培养，整个操作过程都在体外进行。影响ROS 表达量的因素有很多，主要包括体外培养环境和操作过程。前期有研究发现[25]，胚胎在20%氧含量培养后ROS 的表达量明显高于5%氧培养，传统的胚胎评分方法需要频繁开关培养箱，ROS 的表达量就会增多，从而使得胚胎生长没有一个稳定的内环境，因此延迟摄像技术应运而生，应用该技术动态评估胚胎生长过程，可以大大减轻氧化应激对胚胎影响，从而提高胚胎的利用率。

此外，在体外培养的操作过程中，比如胚胎的观察、冷冻以及解冻等，由于受到个人技术的熟练程度影响，也会产生不同程度的ROS，这就需要每一位胚胎学家能够熟练掌握胚胎学操作技术，争取在最短的时间内，完成整个操作过程，减少ROS 的表达量，减轻对胚胎的损伤，提高胚胎质量。

2.2 生物抗氧化剂干预 ROS 表达量直接影响胚胎的发育，为了减轻这种损伤作用，研究发现[26]，一些生物抗氧化剂能够抑制ROS 活性，如氮-乙酰半胱氨酸（NAC）、维生素（Vc）、维生素B5（VB5）以及迷迭香酸等。NAC 是一种常见的抗氧化剂，能够直接与ROS 的代谢离子反应，还可以通过脱乙酰基作用转化为谷胱甘肽（GSH），其是重要的抗氧化剂能够清除ROS 等自由基，减少氧化应激损伤；且有研究发现[27]，当其浓度为1 mmol/L 时，胚胎形成囊胚率最高，抗氧效果最佳。Vc 即所谓的L-抗坏血酸性，具有很强的抗氧化性，能够迅速清除细胞在新陈代谢中产生的一系列氧自由基，与其他的抗氧化剂相比较，它可以与ROS 迅速反应，使胚胎内的低分子量抗氧化剂含量恢复到正常水平，增强其抗氧化作用；VB5作为辅酶A 生物合成所必须的维生素，广泛存在于各种生命组织中，它可以通过促进脂肪酸代谢来消除脂质过氧化物，阻止ROS 进入胚胎，以此减轻氧化应激对胚胎的损伤[28]。研究发现[29]，迷迭香酸（RA）可以有效减轻氧化应激对猪卵母细胞的损伤，其抗氧化机制可能与其化学结构有关，其中羧酸基团与芳香环中的邻苯二酚结构共同作用中和自由基。另有研究表明[30]，RA 可以通过降低细胞内ROS水平来抑制H2O2诱导的N2A 细胞的细胞毒性，此外，RA 也有效地减弱β-淀粉样蛋白诱导的脂质过氧化和减少PC12 细胞中ROS 的积累。

3 总结

随着社会经济的快速发展，不孕不育已经成为大家所关注的焦点，辅助生育技术也因此被大家提出，成为了近年来研究的热点，在其发展的过程中，越来越多的问题引起了科研工作者的关注。影响此项技术的因素有很多，其中氧化应激反应贯穿于整个胚胎的发育过程中。但至今为止，氧化应激对胚胎的影响机制尚未明确，应用不同的干预措施，尽可能的减少氧化应激对胚胎的损伤作用，可为辅助生育技术提供更有利的帮助。