肝衰竭合并侵袭性真菌病的诊断策略*

李 丽 李秀惠 陈 煜

1.首都医科大学附属北京佑安医院中西医结合中心 (北京， 100069) 2.首都医科大学附属北京佑安医院疑难重症肝病及人工肝中心

肝衰竭是由多种原因引起的严重肝功能损伤，病死率高。肝衰竭患者在病程中常常出现免疫功能抑制[1]，且应用抗菌药物、糖皮质激素也很常见，侵袭性真菌病(IFD)的发生机会显著增加。由于真菌感染临床症状不典型，且常与细菌感染并存，诊断困难，治疗周期长、难度大，病死率更高。早期诊断、及时治疗成为改善肝衰竭合并IFD预后的关键。笔者梳理了肝衰竭合并IFD的诊断策略，为临床医生提供参考。

1 肝衰竭合并IFD的流行情况

IFD是指真菌侵入人体，在组织、器官或血液中生长、繁殖，并导致炎症反应和组织损伤的感染性疾病[2]，文献报道肝衰竭合并IFD的发生率为2%～15%[3]，病原学以白色念珠菌和曲霉菌为主[4]，感染部位以肺部和口腔为主[5]。最近国内有报道分析了2008至2017年某医院3 233例符合肝衰竭诊断的患者，其中合并真菌感染患者372例(11.5%)，病原学主要菌属为念珠菌(占55.92%，其中白色念珠菌占35.92%)和曲霉菌(占42.85%，其中烟曲霉菌占34.69%)，隐球菌和毛孢子菌仅分别占0.82%和0.41%。呼吸道感染占60.05%，口腔感染占29.91%，其次依次为泌尿道(4.34%)、腹腔(2.97%)、消化道(1.14%)、胸腔(0.68%)、血液(0.68%)、胆道(0.23%)[6]，国内其他报道的感染部位分布结果类似。肝衰竭合并IFD的28 d病死率达56%，90 d病死率可达71%，预后极差[7]。

2 肝衰竭合并IFD的危险因素

对于重症患者，目前公认的IFD危险因素包括宿主和治疗方面[8, 9]。宿主方面的危险因素包括：①年龄>65岁；②合并重要脏器功能不全，如肝硬化、肾功能不全、肠功能减退、慢性阻塞性肺疾病、糖尿病等；③存在念珠菌定植。治疗方面的危险因素包括：①侵入性操作：机械通气、动静脉置管、留置尿管及其他引流管、血液净化治疗等；②药物治疗：长期使用3种以上广谱抗菌药物、糖皮质激素治疗等。

需要指出的是，在欧美国家的指南中，上述危险因素不被认为是诊断IFD的依据[9]。作为临床诊断条件的宿主因素主要包括存在免疫缺陷或免疫抑制的以下情况：①中性粒细胞减少<0.5×109/L 持续超过10 d；②过去60 d内采用糖皮质激素治疗(≥0.3 mg/kg)3周以上；③过去90 d内接受T细胞免疫抑制治疗；④接受B细胞免疫抑制治疗；⑤血液病；⑥干细胞或实体器官移植受体；⑦先天性严重免疫缺陷；⑧移植物抗宿主反应(Ⅲ或Ⅳ级累及消化道、肺、肝且一线糖皮质激素治疗无效)。

包括肝衰竭在内的重症或终末期肝病普遍被认为存在免疫缺陷[10]，但尚不能作为诊断IFD的宿主因素。越来越多证据表明，肝衰竭自身特点是发生IFD的独立危险因素，包括腹水白蛋白水平<1 g/dl、高MELD评分、高CTP评分、合并肾功能损伤、ICU治疗、血管或腹腔内置管等[10]。以上情况需要警惕患者发生IFD的可能性，并及时寻找证据，早识别、早诊断、早治疗。

3 肝衰竭患者的早期识别

当肝衰竭患者临床出现以下情况时应考虑IFD发生的可能性[10]：①使用广谱抗菌素治疗后体温得到控制而后复升，或使用广谱抗菌素治疗48～72 h无效；②口腔黏膜真菌感染伴全身感染症状；③外周血白细胞及中性粒细胞比例升高，广谱抗菌素治疗无效；④肝硬化患者病情迁延或加重；⑤肺实变及肺浸润性改变、抗菌素治疗无效。需进一步寻找真菌感染证据。

4 肝衰竭合并IFD的诊断方法

考虑到IFD感染的可能性，可进行以下检测方法寻找病原。

4.1 实验室检查

4.1.1 真菌抗原检测 真菌抗原检测是真菌感染无创、早期诊断的重要血清学筛选指标，主要包括1,3-β-D葡聚糖(BDG)、半乳甘露聚糖(GM)。①BDG试验(G试验)。BDG广泛存在于各类真菌(毛霉菌和隐球菌除外)细胞壁，占胞壁成分50%以上。当真菌进入人体，经吞噬细胞吞噬、消化后，释放BDG，血液或其他体液中即可检测到BDG[11]。G试验对除隐球菌和毛霉菌以外的所有深部真菌感染的早期诊断非常有帮助，尤其是念珠菌和曲霉菌，但不能确定菌种。G试验检测阳性最早可于临床症状出现前4 d，或发热前5 d被检测到，是早期检测的重要手段[12-15]。目前文献报道中常用的BDG检测试剂盒包括Fungitell、Glucatell 试剂盒(主要用于欧美国家)，Fungitec-G 、Wako 试剂盒(主要用于日本)，Dynamiker Fungus试剂盒(主要用于中国)。最近一项系统综述对不同试剂盒检测免疫缺陷或危重患者真菌感染的准确性进行了分析，根据推荐的截断值(cut-off)水平，真菌检测的敏感性为 27%～100%，特异性0% ～100%。各研究之间产生异质性的原因包括试验设计、目标人群、真菌类型、抽样误差、检测截断值等因素，未来需要更多研究改善异质性，提供可靠的敏感性和特异性结果[16]。②GM试验。GM分布于大多数曲霉及青霉属真菌胞壁中，是曲霉菌检测的特异性分子标志物。GM试验方法主要是酶联免疫吸附试验(ELISA)，是IFD尤其是侵袭性曲霉菌病(IA)的筛选试验，适用于具有IFD高危因素的成人或儿童患者。IA患者血清GM阳性早于临床表现和影像学改变，连续GM试验动态监测具有早期诊断价值。肺泡灌洗液的GM试验比血的GM试验数值对诊断曲霉菌感染具有更高的特异性和敏感性[17, 18]。GM>0.5时敏感性可达100%，特异性超过75%[19, 20]。

4.1.2 荧光定量PCR检测真菌DNA 荧光定量PCR检测血液中的真菌已经有大量报道[21, 22]，实时荧光PCR检测血清样本曲霉DNA可协助诊断肝衰竭合并IA。新鲜组织标本可用于毛霉核糖体DNA(rDNA)小亚基半巢式 PCR 检测，呼吸系统活检标本PCR 结果的敏感性优于组织病理检查和真菌培养[23]。由于实验室检查PCR的技术尚未标准化，商业检测试剂盒还未得到广泛应用，目前PCR检测没有被纳入EORT/MSG的推荐意见。

4.1.3 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定技术检测真菌胞内核糖体蛋白 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术，简称飞行质谱技术，是临床微生物鉴定领域的重要技术手段。其机制在于每种微生物自身具有独特的肽/蛋白质，MALDI-TOF MS用来检测微生物胞内核糖体蛋白，经系统处理后得到与蛋白成分对应的质谱峰图，然后与数据库内菌株的参考质谱峰图进行比对，根据谱图相似程度对微生物进行菌种鉴定。MALDI-TOF MS已应用于细菌、酵母菌、丝状真菌菌种的鉴定，可在几分钟之内完成对微生物种、属水平的鉴定[24-26]。MALDI-TOF MS具有快速、准确、高通量、低成本的优势[27, 28]。由于真菌本身的复杂性以及现有数据库内真菌菌种涵盖范围有限，其鉴定能力还有待提高。

4.1.4 体液直接镜检、涂片和真菌培养 各种体液可进行直接镜检、涂片或培养发现真菌。体液标本包括血液、正常无菌部位的穿刺液、呼吸道分泌物、尿液、各种引流液(胸腹水、脑室引流液)。对于血液、无菌腔液或组织液进行涂片并染色，可快速发现真菌[29, 30]。毛霉素镜下特征表现为宽度不一、无隔或少隔的丝带状菌丝体。双相真菌(如马尔尼菲蓝状菌)镜下可见“腊肠样”菌体，不着色横隔是马尔尼菲蓝状菌的典型特征。怀疑隐球菌脑膜炎者，应进行脑脊液的印度墨汁染色，镜下未染色的荚膜是隐球菌的特征。卡氏肺孢子菌不能通过体外培养获得，主要依靠肺泡灌洗液直接涂片进行六胺银染色诊断。体液真菌培养阳性者，需进一步进行真菌属、种的鉴定。

4.2 组织病理学检查 感染部位病理组织找到真菌病原体是诊断IFD的金标准。通过切片、染色观察真菌的形态和组织反应。常用染色方法包括革兰染色、HE染色、姬姆萨染色、PAS染色、嗜银染色(GMS)、黏蛋白卡红(MCS)染色、Gridly真菌染色(GF)等[31]。根据组织中发现的病原体及局部组织反应判别是致病菌或定植菌，组织反应的基本病理改变包括急慢性化脓性炎症、非化脓性炎症、肉芽肿形成、干酪样坏死、血管炎等。凝固性坏死较多见于曲霉菌和念珠菌感染，毛霉菌和新生隐球菌肺炎常出现楔形梗死灶[32]。临床怀疑 IFD 时，尽量多次抽血、无菌腔液进行真菌培养，尽可能行组织病理检查协助诊断。但重症肝病患者常由于凝血时间延长难以获得组织标本，同时真菌培养时间长、阳性率低，早期确诊仍是挑战。

4.3 影像学检查 影像学检查是诊断IFD的重要手段，有助于判断感染部位、感染类型、病灶数量、大小、局部浸润，可在CT引导下行穿刺活检。高分辨CT(HRCT)对于IA有重要意义。典型表现为伴或不伴晕征的结节病灶(>1 cm)或楔形坏死病灶，结节中出现新月征和空洞形成，是曲霉菌侵犯肺部的临床诊断标准。感染还可累及肺泡和细支气管壁，表现为支气管周围实变影、支气管扩张征、小叶中心型微小结节影、树芽征和毛玻璃样改变等表现，为曲霉菌气道侵袭的特征性表现[32]。毛霉病患者影像学检查可出现反晕轮征，有研究表明，19%的毛霉病患者出现反晕轮征，而仅<1% 的曲霉病患者出现类似的改变。

5 肝衰竭合并IFD的诊断

目前国内外尚无关于肝衰竭合并IFD诊断标准的指南或共识，可参考2007年中华医学会重症医学分会制订了《重症患者侵袭性真菌病诊断与治疗指南(2007)》[8]，以及国外《EORTC/MSG侵袭性真菌病指南》2019年更新版[9，33]。国内外均将IFD的诊断分3个级别：确诊、临床诊断、拟诊，诊断依据包括宿主因素、临床特征、微生物学检查、组织病理学4部分。上述国内外指南对于宿主因素的界定有所不同，国外诊断标准对宿主因素做了严格限定，国内指南则将危险因素、宿主因素合并成为危险(宿主)因素，而肝衰竭发生IFD的独立危险因素是否应当列入指南仍有待于形成统一意见。

5.1 确诊

5.1.1 霉菌感染 具有以下情况之一可确诊为霉菌感染。①针吸或活检获得的组织病理、细胞病理或直接镜检，可见菌丝或产黑色素酵母样真菌并伴有组织损伤证据；②正常无菌部位由临床或影像学发现感染病灶，无菌操作下获得标本培养得到透明或黑色霉菌(不包括肺泡灌洗液、鼻旁窦、乳突窦、尿液)；③血培养得到真菌，如镰孢菌等(曲霉菌多为污染菌)；④石蜡病理切片发现霉菌，行PCR真菌DNA扩增及DNA测序确定。

5.1.2 酵母菌感染 具有以下情况之一可确诊为酵母菌感染。①正常无菌部位针吸或活检取得的标本进行组织病理、细胞病理或直接镜检可见酵母菌细胞，如带有荚膜、出芽的隐球菌，有菌丝或假菌丝的念珠菌；②无菌部位由临床或影像学发现感染病灶，无菌操作下获得标本(包括24 h内引流液)，培养得到酵母菌；③血培养：酵母菌(如隐球菌或念珠菌)或酵母样菌(毛孢子菌)培养阳性；④脑脊液或血清隐球菌抗原阳性；⑤石蜡病理切片发现酵母菌，行PCR真菌DNA扩增及DNA测序确定。

5.1.3 其他真菌感染 ①肺孢子菌：组织、肺泡灌洗液、痰液进行传统或免疫荧光染色可见肺孢子菌；②地方性真菌病：感染部位标本的病理学或直接镜检可见特征性真菌；感染部位标本培养发现特异性真菌；血培养发现特异性真菌。

5.2 临床诊断 做出临床诊断需要综合宿主因素、临床特征、真菌微生物学检测结果。要求至少具有1项宿主因素，具有可能感染部位的临床特征(包括症状、体征、影像学表现)，并同时具备至少1项以下真菌微生物学检测结果阳性[8]。①血液、胸腹水等针吸无菌体液涂片发现隐球菌以外的真菌；②留置导尿、连续2份尿检见念珠菌管型或尿培养呈酵母菌阳性；③直接导尿获得的尿样培养呈酵母菌阳性(尿念珠菌>103CFU/ml)；④更换尿管前后2份尿样培养呈酵母菌阳性(尿念珠菌>103CFU/ml)；⑤气道分泌物(包括经口、气管插管、支气管肺泡灌洗、保护性标本刷获取的标本)直接镜检/细胞学检查发现菌丝/孢子或真菌培养阳性；⑥经胸、腹、盆腔引流管等留取的引流液直接镜检/细胞学检查发现菌丝/孢子或真菌培养阳性；⑦经脑室引流管留取的标本直接镜检/细胞学检查发现菌丝/孢子或真菌培养阳性；⑧连续2次血液标本GM试验和/或G试验检测阳性。

5.3 拟诊 具有1项宿主因素，具备1项上述真菌微生物检测结果阳性或者仅具有可能感染部位的临床特征。

6 中医对肝衰竭合并IFD的认识

目前真菌感染的中医辨证报道较少，肝衰竭(重型肝炎)合并IFD辨证分型的报道则更少。中医认为肺部真菌感染当属“咳嗽”、“肺痿”、“肺胀”、“虚劳”、“风温”等病范畴[34]。关于其证型，可分为虚实两证，虚证以阴虚、气阴两虚为常见，实证多表现为风温之邪侵袭肺体[35]。肺念珠菌病可分为痰湿郁肺、痰热蕴肺、肺阴亏虚型等证型[36]；肺霉菌感染可分为温邪犯肺型及阴虚火旺型[37]。

王灵台教授团队对1996至2003年住院治疗的74例重型肝炎并发真菌感染患者的中医证候进行了分析，发现痰热证、热毒证及湿热证与重型肝炎并发真菌感染有密切关系，提示中医的痰热证、热毒证及湿热证的出现是重型肝炎并发真菌感染的危险因素[38]。

7 总结

肝衰竭作为特殊的重症疾病类型，由于患者凝血机制差，获取病理确诊较为困难，血培养以及临床诊断更为重要，详细分析患者的危险因素、早期识别临床特征、及时进行血液/体液微生物学检测是早期诊断的重要策略。而肝衰竭宿主因素作为真菌感染的诊断依据国内外尚未共识，有必要在未来加强临床和基础研究，为指南制定提供依据。