肝脏靶向基因治疗的临床研究进展

汪艳

通过加入异源遗传活性物质对生命单元中的原有遗传物质进行活性改变或补充等可统称为基因干预，应用于临床则称之为基因治疗。基因治疗的目的包括治疗、治愈或预防某种疾病或医学状态。基因治疗可通过多种机制策略实现临床目的，主要包括：用健康版本替代致病版本的基因；使致病基因的不正常功能失活；引入一个新的或改造后的基因。基因治疗可以有体内和体外治疗方式。前者是指将基因治疗物质直接通过循环系统进入人体；后者是指先将该患者的细胞取出，经过基因治疗物质处理后，再将这些细胞输回患者。基因治疗制品根据携带传递遗传片段的载体种类，可以简单归为质粒、病毒类载体、细菌载体、转基因细胞以及生物材料载体等。基因治疗的所有技术环节涉及，如遗传活性物质构建、载体传递方式、给药环节以及安全与疗效检查等，均需要复杂的各类专业研究实验数据交替支撑。

应用于人类的基因治疗在上市之前，需要按照各国政府机构的具体管理要求以相应的特殊新药申请流程开展临床试验。大多数国家仅允许靶向体细胞的基因治疗研发，涉及临床疾病包括某些类型肿瘤、遗传性疾病以及某些病毒性感染。截至2021年2月5日，美国获批上市的列为细胞与基因治疗制品/药物的共有9个：3个为病毒载体(腺病毒/腺相关病毒、单纯疱疹病毒-1)、6个为转基因细胞(骨髓/血单核细胞)；其中无针对肝脏疾病的制品/药物[1]。

另一方面，基于靶向RNA技术的治疗性新药研发，如反义寡核苷酸(ASO)类分子药物和小分子干扰RNA(siRNA)类分子药物，在近5年开始有较大突破[2]。 尤其是特异性针对肝细胞的此类新药，如2018年Inotersen(ASO)和Patisiran(siRNA)在欧洲和美国双双获批，针对性抑制肝细胞中转甲状腺素蛋白表达，治疗遗传性甲状腺素蛋白介导淀粉样变。2019年11月和2020年11月，分别针对急性肝性卟啉病和I型原发性高草酸尿症的siRNA类药物Givosiran和 Lumasiran通过孤儿药候选药物认证和突破性治疗的双途径，相继在欧洲和美国获批上市，它们分别是首个针对性抑制肝细胞中氨乙酰丙酸合成酶-1 和羟基酸氧化酶-1表达的基因治疗分子药物，设计上采用了相同的策略，即在分子设计上连结了N-乙酰半乳糖胺基团，特异性靶向肝细胞上的去唾液酸糖蛋白受体，减少肝脏代谢产生的δ-氨基乙酰丙酸/胆色素原和草酸，阻止相关疾病的发生和进展[3-4]。 同时，这些药物上市后的安全性和疗效情况还需要更多观察数据，这是因为，其所针对病种通常比较稀缺，意味着患者人群数量少且入组者常已处于特殊进展阶段，疾病评价终点指标有限，临床试验设计困难，缺乏长期随访数据[5]。 但其设计过程突出“个体化”能力，与个体基因组深度测序分子诊断技术相结合，在探索致死性的罕见遗传病治疗方面已经开始展示出令人兴奋的研发效率和应用潜力[6]。

总体上，尽管相关研发知识和工具不断积累增加，基因治疗研发目前仍然处于发展阶段，存在由于某些环节未知而造成的危险因素，如致死、免疫系统严重不良反应、非靶向细胞中靶、形成持续感染、致瘤致癌、再活化等，也涉及较多特殊的伦理考虑，因此大多仅用在其他疗法无法处理的疾病情况。对于采取了插入整合基因组或基因组编辑技术的基因治疗新药试验的长期观察期限，美国FDA最新发文建议为使用后不少于15年[7]。

肝脏是基因治疗单基因遗传病的常见靶向器官。主要是因为肝脏在物质代谢、解毒、凝血、消化、免疫等多种基础功能方面发挥重要作用，对全身主要器官组织产生直接支持。靶向肝脏的基因治疗往往是缘于修复、维持或借助肝脏功能的目的，采用相应技术细节，如Givosiran和Lumasiran分子结构中的肝细胞靶向设计N-乙酰半乳糖胺基团使得异源物特异性地进入肝脏细胞，或在转基因序列中设计加入肝细胞特异性的表达调控元件，使得特异性针对某种肝功能相应的遗传分子表达，在性质、水平和时间上实现预定的功能学改变，并理论上避免设计之外的其他活性作用[3, 4]。

病毒类载体在各类载体中的使用量约64.5%[8]，具有转染效率高的特点。在靶向肝脏的基因治疗中，腺相关病毒(AAV)是目前最常用的病毒类载体之一。AAV是一类单链DNA病毒，属于细小病毒科。AAV载体感染细胞后可随机插入染色体，装载基因长期表达或潜伏。 AAV存在天然复制缺陷，尚未发现AAV与人类疾病有相关性。AAV体内注射常引起显著不良免疫反应，对治疗流程和效果产生不利影响。针对该困难，有研究不断探索新技术策略，如将具有针对性免疫调节活性的非编码DNA短序列直接与具有治疗作用的DNA长序列相连结，改造了AAV载体基因组，动物模型实验发现对AAV治疗相关的局部不良免疫反应产生显著抑制效果[9]。 此外，腺病毒、慢病毒载体也是常见应用工具。腺病毒是双链DNA病毒，可以携带较长基因片段，感染肝细胞的效率也比较高，但可以引起比较强的免疫不良反应；慢病毒是RNA病毒，会将外源基因整合到宿主细胞的基因组长期表达，需要长期观察其安全性[7]。也有采用相对简单的寡核苷酸裸分子、质粒或纳米粒等非病毒载体形式进行基因给药。此类方式引起免疫系统不良反应的情况相对病毒载体比较小，但其技术在临床可行性、传递过程和感染效率等方面目前大都尚不及病毒载体技术。

根据截至目前临床试验网站(ClinicalTrials.gov)内容，已经完成或正在招募或正在活跃状态的肝脏相关疾病基因治疗临床试验项目主要涉及了肝脏肿瘤、单基因遗传性疾病、免疫性肝脏炎症和病毒性肝炎。以前两者比例最高，分别为63.9%和25.0%。在这些试验中，肝脏肿瘤治疗试验近期多采用将体外基因工程改造后的免疫细胞输回患者，还有一些将构建的病毒载体或纳米颗粒直接注入瘤体或其血供系统；重组的腺病毒、单纯孢疹病毒、水泡性口炎病毒等都曾用作这些治疗的病毒载体。单基因遗传性疾病临床试验主要涉及了α1-抗胰蛋白酶缺乏症、威尔森氏病、甲型血友病、粘多糖贮积症、急性间歇性卟啉病、家族性高胆固醇血症；近年来其体内给药以使用AAV载体为主。这些内容代表性地反映了肝脏靶向基因治疗临床研究进展的基本情况。