microRNA在原发性胆汁性胆管炎发病机制及诊断治疗中的作用

裴昱丰 王萍 贾继东

微小核糖核酸(microRNA, miRNA)是一类长度为19～24个核苷酸的非编码小RNA分子，可以通过碱基互补配对原则与靶基因mRNA的3’端非转录区(3′ untranslated region, 3′UTR)相结合，在转录后水平促进目标mRNA的降解或阻止其翻译从而下调该基因的表达。作为重要的表观遗传学分子，miRNA可参与细胞命运决定、免疫功能调节、组织发育调控等多种生物学过程。目前已经发现了2 500余种miRNA分子，而一个miRNA可以调节上百个编码基因的表达，因此miRNA和基因表达的关系非常复杂。

原发性硬化性胆管炎(Primary biliary cholangitis, PBC)是一种自身免疫介导的、中年女性多发的肝内胆汁淤积性疾病。本病临床上以血清中碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)升高和抗线粒体抗体尤其是M2亚型(Anti-mitochondrial antibody subtype M2，AMA-M2)阳性为主要特点，病理上以肝内小胆管细胞非化脓性变性、坏死及汇管区淋巴细胞浸润为主要特征。PBC患者肝组织[1]、外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells, PBMC)[2]、血清[3]中miRNA的表达谱均有显著变化，这些差异表达的miRNA可参与激活免疫反应、促进胆管细胞凋亡等过程，从而导致PBC疾病的发生与进展。本文将综述miRNA调控PBC发生、进展的细胞分子机制和miRNA用作PBC疾病的诊断标志物和治疗靶点的研究进展。

一、miRNA调控PBC疾病发生、进展的细胞分子机制

(一)miRNA参与PBC中免疫细胞的活化过程 PBC的发生、进展过程涉及多种免疫细胞的功能失调，包括调节性T细胞(regulatory T cells, Treg)功能下降、具有促炎作用的辅助性(T helper, Th)17细胞增多、汇管区CD4+与CD8+T淋巴细胞浸润、B细胞产生针对抗线粒体E2亚基(Pyruvate dehydrogenase complex E2, PDC-E2)的自身抗体等。利用基因芯片对PBC患者与健康对照PBMC、CD4+T淋巴细胞和B淋巴细胞检测结果发现，很多差异表达的miRNA在PBC免疫细胞活化方面发挥了重要作用。

1. PBMC中miR-155表达增加与Treg细胞的免疫抑制功能下降有关

与健康对照相比，PBC患者PBMC中具有免疫抑制功能的Treg细胞数量与比例均显著下降，Treg细胞分泌的、具有抑炎作用的白细胞介素(Interleukin, IL)-10也明显减少，导致T细胞数量增加、抗原递呈细胞(包括树突细胞和B细胞)中共刺激分子CD86表达显著增加，进而促进了PBC的疾病进展[4]。细胞因子信号转导抑制因子(suppressor of cytokine signaling, SOCS)-1可增强Treg细胞的免疫抑制功能[5]，而PBC患者肝组织中，SOCS-1表达水平与Treg细胞标志物FoxP3表达水平的比值较健康对照显著下降，同时miR-155水平显著升高，提示miR-155表达增加可能参与了降低Treg细胞的免疫抑制功能，导致炎症反应加重[6]。

2. PBMC中miRNA-92a表达下降增加了促炎Th17细胞数量

IL-17是主要表达于Th17细胞的促炎细胞因子。与健康对照相比，PBC患者血清中、PBMC中及肝脏汇管区IL-17水平均显著升高，而且PBMC中IL-17的表达水平与PBC严重程度正相关[7]，提示Th17细胞数量增加或功能增强可能与PBC疾病密切相关。PBC患者血清miR-92a的水平较健康对照显著降低，且miR-92a水平与Th17细胞数量增加之间呈负相关，表明miR-92a表达降低与PBC患者中促炎Th17细胞数量增加有关[3]。

3. CD4+T细胞中miR-425、miR-181a表达下降加重了PBC的炎症反应

PBC患者胆管细胞表达的PDC-E2递呈给CD4+T细胞后，PBC患者的外周血、肝脏、肝脏引流淋巴结中，针对PDC-E2的自身反应性CD4+T细胞数量较健康对照显著增加，同时Th1细胞表达的干扰素(Interferon, IFN-γ)水平亦显著升高。在PBC患者CD4+T细胞中发现了5个较健康对照者表达显著下调的miRNA (miR-181a、181b、361-5p、374b和425)[8]。其中，miR-425可以结合到N-Ras mRNA的3’-UTR区并抑制其表达，而N-Ras具有促进炎症因子IL-2与IFN-γ表达[8]和促进CD4+T细胞活化的作用[9]。PBC患者CD4+T细胞中N-Ras表达显著增加[9]，可能是由于miR-425表达下降导致了N-Ras水平升高，加重了CD4+ T细胞介导的炎症反应。另外，miRNA-181a也是被验证过在PBC患者CD4+T细胞中较健康对照、慢性乙型肝炎患者表达显著下降的miRNA，其表达水平与靶基因BCL-2表达水平呈负相关，提示CD4+T细胞中miR-181a表达降低使得BCL-2表达增加，由于BCL-2具有抑制淋巴细胞凋亡的作用，提示miR-181a可能与PBC中CD4+T细胞相关炎症反应加重有关[10]。

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4. B淋巴细胞中miR-223-3p、miR-21-5p表达下降与自身抗体分泌增加有关

在PBC患者，持续的B细胞活化导致了血清PDC-E2抗体、抗核抗体(gp210、sp100)水平显著升高[11]。与健康对照相比，PBC患者外周血B淋巴细胞中有558个差异表达的miRNA，其中miR-223-3p和miR-21-5p的表达从I期到III期PBC患者持续显著下降。这些miRNA所针对的靶基因涉及细胞迁移、分化、凋亡和信号传递等生物学过程，可能与PBC疾病进展过程中B细胞成熟分化、分泌针对PDC-E2抗体有关[12]。

(二) miRNA参与胆管细胞功能障碍和肝细胞损伤的过程 PBC以表达PDC-E2的胆管细胞受到免疫细胞特异性攻击为特征。尽管研究发现遗传因素、环境因素都可能参与了PBC的诱发过程，但是具体诱因目前仍未确定。一些证据显示，miR-26a、miR-506表达增加导致胆管细胞功能障碍；而miR-210与miR-21参与了PBC所致肝脏胆汁淤积对肝细胞的损伤过程。

1. 胆管细胞中miR-506表达增加导致其功能障碍

利用miRNA芯片技术比较PBC肝移植患者的病肝组织与非肝病对照者的肝组织，发现了35种差异表达的miRNA[1]。后续研究发现，其中的miR-26a与miR-506参与了PBC的疾病发生过程。

PBC患者肝组织中高表达的miR-26a，可以特异性地靶向多梳家族蛋白——Zeste2多克隆抑制复合物2亚单位增强子 (enhancer of zeste 2 polycomb repressive complex 2 subunit，EZH2)，导致EZH2蛋白表达水平降低[13]。由于EZH2能通过募集Bmi1促进胆管细胞增殖、抑制其衰老[14]，因此miR-26a可能通过降低EZH2的表达，从而发挥抑制胆管细胞增殖、促进其衰老的作用。

miR-506特异性地表达于胆管上皮细胞，在PBC患者肝组织中其表达水平显著增加[15]。促炎细胞因子IL-8、IL-12、IL-17、IL-18及肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α具有上调miR-506表达的作用[16]。过表达miR-506可以增加胆管上皮细胞内的活性氧水平、PDC-E2表达水平及DNA损伤标志物的表达水平，而且增加的PDC-E2不仅位于细胞质中，也位于细胞膜上，这导致胆管细胞成为免疫细胞攻击的靶点[16]。

正常情况下，胆管细胞通过分泌HCO3-使胆汁呈弱碱性，并形成碳酸氢盐保护伞，从而避免胆汁酸直接作用于胆管细胞。当胆管细胞miR-506表达增加时，miR-506可以结合到Cl-/HCO3-阴离子交换蛋白2(anion exchanger 2，AE2)mRNA的5’-UTR区，进而降低胆管细胞的AE2表达水平与活性[15]。由于AE2是分泌素刺激胆管细胞分泌碳酸氢盐、维持胆汁pH稳态的关键分子，缺少AE2使得胆管细胞对疏水性胆汁酸鹅脱氧胆酸或甘氨鹅去氧胆酸诱导的细胞凋亡更加敏感[16]。miR-506还可结合于胆管细胞特异性表达的三磷酸肌醇受体(inositol 1,4,5-trisphosphate receptor, InsP3R)mRNA的3’-UTR区域，降低其蛋白表达水平[17]。由于InsP3R3能通过Ca2+信号来调控胆管细胞向胆汁中分泌碳酸氢盐[18-19]，故缺少InsP3R可以抑制胆管细胞碳酸氢盐的分泌过程，导致胆管细胞处于应激状态且细胞凋亡增加[20]。有研究结果显示，向胆管上皮细胞中转染miR-506的反义序列可以降低miR-506水平，从而降低PDC-E2表达、促进胆管细胞碳酸氢盐分泌、减轻胆管细胞损伤，是非常有前景的PBC治疗靶点[15]。

2. 肝细胞中miR-210与miR-21表达增加加重了胆汁淤积对肝细胞的损伤

在PBC的病理发生过程中，胆管细胞损伤所导致的胆汁淤积状态也会对肝细胞产生不利影响。有研究发现，胆汁淤积性肝损伤小鼠模型和PBC患者肝组织中miR-210与miR-21的表达水平较正常对照均显著增加。miR-210能抑制肝细胞中法尼醇X受体(farnesoid X receptor, FXR)的共刺激分子——混合性白血病甲基转移酶(methyltransferase in mixed-lineage leukemia, MLL)4基因表达，从而阻断MLL4促进小异二聚体伴侣分子(small heterodimer Partner, Shp)和胆盐输出泵(bile salt export pump, Bsep)基因的表达，最终导致肝脏胆汁酸代谢障碍与胆汁淤积[21]。miR-21可通过细胞周期蛋白依赖激酶2相关蛋白1 (cyclin-dependent kinase 2-associated protein 1, CDK2AP1)促进肝细胞坏死；去除miR-21能够减轻肝细胞坏死、改善对胆汁酸的适应性应答、并能够改善氧化应激与肝纤维化[22]，提示miR-21有可能作为胆汁淤积性肝病的治疗靶点。

二、miRNA有助于PBC的鉴别诊断、疾病分期评估和疗效评价

miRNA在血清中稳定存在，不易被RNA酶降解，所以血清和PBMC中差异表达的miRNA都可能作为辅助PBC诊断和评价疗效的生物标志物。

(一)miRNA可作为PBC诊断的辅助标志物 PBC发病隐匿，目前临床多根据血清ALP水平、AMA-M2滴度及肝脏组织病理学进行诊断。但是，也有AMA-M2阴性的PBC患者，且早期病例ALP水平并不一定升高。有研究发现，miR-let-7b在PBC患者PBMC中表达水平较健康对照者显著降低，而且与疾病分期、Mayo风险评分、血清 IL-18水平及血清ALP水平呈负相关[23]，有可能作为PBC早期诊断的辅助标志物。

有研究发现，将三种miRNA组合(miR-122-5p、miR-141-3p和miR-26b-5p)诊断PBC的受试者工作特征曲线下面积(area under a receiver operating characteristic curve, AUC)为0.905(95%置信区间：0.857～0.953，敏感性80.5%，特异性88.3%)，其敏感性和特异性高于ALP(AUC=0.537，95%置信区间：0.195～0.434,P<0.001)和ANA(AUC=0.739, 95%置信区间：0.012～0.213,P=0.028 2)，但低于AMA(AUC=0.982，95%置信区间：0.0618～0.198,P=0.0002)；值得注意的是，这种miRNA组合诊断PBC临床前阶段、无症状阶段、有症状阶段及肝功能不全期的AUC分别为0.835、0.879、0.867及0.901[24]，提示该miRNA组合亦可能作为PBC早期诊断的血清标志物。

miR-150可能通过靶向B前体细胞c-Myb mRNA降低转录因子c-Myb的表达水平，进而阻断B细胞发育并降低B细胞抗体合成[25]。有研究发现，AMA阴性PBC患者血清miR-150水平显著高于AMA阳性PBC患者及健康对照组，并与AMA抗体滴度负相关[26]，提示miR-150可以作为辅助诊断AMA阴性PBC的血清标志物。

(二) miRNA有助于PBC与其他慢性肝病的鉴别诊断 PBC与其他慢性肝病的鉴别诊断也是困扰临床医生的问题。血清miRNA深度测序与实时荧光定量PCR验证结果显示，PBC患者血清miR-505-3p和miR-197-3p水平显著低于慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎[27]。另有研究显示，PBMC中 miR-26a、miR-299-5p、miR-328及miR-let-7a水平，可以鉴别PBC与AIH[28]。

(三)miRNA有助于评价PBC患者的治疗应答情况 目前，熊去氧胆酸(ursodeoxycholic acid, UDCA)是PBC治疗首选的药物。尽管UDCA对多数患者的胆汁淤积状况均有一定程度改善，但生化指标检测结果显示仍有30%～40%患者应答不佳。血清miRNA芯片分析结果显示，miR-125b、let-7b和miR-520a-5p有助于识别出UDCA应答不佳的PBC患者[29]。而PBMC中miRNA检测结果显示，UDCA应答不佳者miR-299-5p表达显著高于正常对照者，并与ALP、GGT、总胆红素、IgM水平呈正相关，而且中重度胆管炎PBC患者(2-3级)比轻度胆管炎PBC患者(0-1级)的miR-299-5p表达水平更高[28]，提示PBMC中的miR-299-5p有可能作为评价UDCA应答不佳患者的指标。

三、总结与展望

总之，多种miRNA分子参与了PBC疾病发生、进展中免疫细胞的活化过程与肝脏细胞的损伤过程。针对肝脏细胞损伤过程，miR-506的反义序列具有减轻胆管细胞损伤的作用，miR-21可以改善肝细胞对胆汁酸的适应性应答，都是非常有前景的PBC治疗靶点。针对免疫细胞活化过程，尽管发现了很多相关的miRNA，但目前相关机制研究尚不充分，仍未发现可用于治疗PBC的miRNA靶分子。

基于PBC患者血清和PBMC中miRNA，目前发现了一些在PBC疾病鉴别诊断、分期评估和疗效评价方面有价值的miRNA或miRNA组合，是对目前临床上通过血清ALP水平、AMA-M2滴度及肝脏组织病理学对PBC疾病进行评估的重要补充，期待经过大规模的临床前验证后，能够有相关的诊断试剂盒应用于临床，以提高PBC患者诊断的准确性，帮助医生尽早发现UDCA应答不佳患者并优化治疗策略。