机械灌注对DCD供肝移植术后胆道并发症影响的研究进展

侯宾，宋红丽（.天津医科大学一中心临床学院，天津 3009；.天津市第一中心医院器官移植科，天津市器官移植重点实验室，中国医学科学院移植医学重点实验室，国家卫生健康委员会危重病急救医学重点实验室，天津 3009）

目前心脏死亡供体（donation after cardiac death，DCD）肝移植已成为治疗患者终末期肝病最为有效的方法［1-3］。之前的研究表明，DCD肝移植术后胆道并发症发生率为10%～30%，是肝移植后发病甚至死亡的主要原因，严重影响术后患者移植物功能恢复以及患者的生存状况［4-7］。因此，DCD肝移植受者术后胆道并发症的高发病率引起了广泛关注，以期对发病机制有更深入的了解，从而可以制定预防策略。因此，为了深入了解机械灌注保存DCD供肝对肝移植术后胆道并发症的发病机制，提高患者生活质量，本综述对此进行详细归纳。

1 DCD肝移植术后胆道并发症的分型和形成因素

胆道并发症可以分为3种类型：胆漏、吻合口狭窄（anastomotic stenosis，AS）和非吻合性胆道狭 窄（non-anastomotic biliary stenosis，NAS）［8］。其中AS和NAS是DCD肝移植后胆道并发症中最常见的类型，发生率分别为1%～15%和5%～30%［8］。研究证实，肝移植术后胆道并发症的产生主要是3个相互关联的机制引发：缺血/再灌注损伤（ischemia reperfusion injury， IRI）、免疫炎症反应介导的组织损伤以及细胞毒性胆汁盐诱导的损伤［9-10］。这3个机制通常相互作用，共同导致胆道并发症的产生，进而严重影响患者术后移植物功能。

因此，通过减少IRI、免疫炎症反应介导的组织损伤以及细胞毒性胆汁盐诱导的损伤则成为预防DCD肝移植术后胆道并发症产生的关键目标［11-13］。其中，IRI被普遍认为是诱发肝移植术后胆道并发症产生的最重要因素，因此，如何有效减少供肝IRI从而降低DCD肝移植术后胆道并发症的发生率，成为目前的研究热点［11-13］。

2 机械灌注保存DCD对肝移植术后胆道并发症的作用

2.1 机器灌注的原理：研究表明采用机械灌注保存供肝的方法能够通过补充氧和营养物质，减少供肝ATP丢失，促进保护性蛋白的产生，显著减少供肝IRI，从而改善边缘供肝移植手术的疗效［14］。在器官移植初期，传统的静态冷保存由于价廉、技术便捷等原因开始成为器官移植保存的金标准［15-17］。然而，随着近几年DCD肝移植技术的不断改善，边缘性供肝的利用不断增加，这类供肝会导致移植物功能障碍以及胆道并发症发生率的增加［11-12］。因此，在肝移植过程中，采用体外对DCD供肝进行灌注保存的方法已成为目前器官移植保存的新方向。

2.2 机器灌注的应用：目前临床正在探索不同的供体肝脏机器灌注方法，包括在不同温度条件下的灌注［11-12，18］。其中，低温（1～18℃）机械灌注、亚低温（20～30℃）和常温（35～37℃）机器灌注的设备已进入临床实践和研究［18］。低温机械灌注是在低温条件下通过灌注机提供动力从而向供肝中持续泵入灌注液，提供营养支持，从而减轻供肝损伤［18-19］。然而，合理的灌注压力以及流速对低温机械灌注过程非常重要，灌注压力过高或者过低都将严重影响肝脏功能，产生供肝IRI［18］。同时当灌注时间超过2 h时，肝移植术后罹患移植物功能障碍的风险将显著增加，严重影响低温机械灌注的使用［18］。亚低温机械灌注是介于低温与常温之间的灌注模式，Bruinsma等［20］对通过亚常温机械灌注供肝的研究表明其可以有效维护肝功能，减少IRI。但目前针对于亚低温机械灌注的研究较少，对于后者的临床使用需要进一步的研究［18］。与其他灌注模式相比，常温机械灌注的一个重要优势在于它可以最大限度地模拟肝脏的生存环境，更好地为供肝提供氧气和营养支持，并且可以在进行移植之前，对处于正常体温条件下的供肝进行功能测试［11-12，15-16］。临床研究表明，常规静态冷藏后短时间的机械灌注可以显著减少IRI［21-22］。因此，采用常温机械灌注保存供肝的方法成为目前的研究热点。

3 机械灌注保存DCD减少肝移植术后胆道并发症

3.1 机械灌注减少胆道IRI：目前DCD移植中胆道并发症发生率较高的主要原因是在肝移植过程中，由于原发性缺血导致DCD供肝缺血期间积累的三羧酸循环中间产物（主要是琥珀酸）会引发肝脏和胆管组织的线粒体功能障碍，引起胆道IRI及后续免疫炎症反应，进而造成肝细胞和胆管上皮细胞损伤［23-24］。研究表明，胆道上皮的免疫炎症反应在术后胆道并发症的发展中发挥至关重要的作用［25］。这可能是由于血管内血凝块的形成导致PVP血供不足，从而导致胆管细胞发生继发性缺血损伤，导致NAS的产生［25-27］。其次，表达于DCD供肝中胆管上皮表面的ABO血型抗原，可能与受者胆管上皮表面的ABO抗体发生特异性结合，形成抗原抗体复合物，从而导致胆道上皮细胞直接损伤［25-27］。此外，巨细胞病毒（cytomegalo virus，CMV）感染与吻合口狭窄和胆汁漏有关［28］。研究表明，CMV可以直接引起胆道上皮细胞的损伤，同时，PVP中内皮细胞的感染可能导致微血栓的形成，从而导致胆管壁和上皮的继发性缺血性损伤［25-26］。最后，趋化因子受体CCR5的突变导致CCR5表达降低，与NAS的发展关系密切［29-31］。CCR5显著表达于免疫细胞，可以与胆管上皮细胞表面存在的CCR5结合位点特异性结合，因此，当患者CCR5发生突变，CCR5的表达减少将严重影响调节性T细胞的趋化，这可能导致炎症反应加重，加重胆管损伤［32］。

采用机械灌注的方法可以保证供肝在体外保存阶段组织内部的血液供应，从而主动降解琥珀酸盐等代谢产物，减少活性氧（reactive oxygen species，ROS） 的产生，进而抑制下游炎症因子活化［33］。同时，由于供肝局部缺血导致胆管组织内ATP耗竭，后者消耗的主要途径包括胆盐转运蛋白、离子通道泵和细胞有丝分裂活动［11，34］。而采用机械灌注的方法可恢复线粒体功能并提高肝脏和胆管组织的ATP水平，对于维持再灌注期间肝脏和胆管组织的再生能力至关重要［11-12，34-35］。

3.2 机械灌注减少胆道细胞毒性胆汁盐的产生：研究表明，患者体内胆汁盐/胆汁磷脂的异常比例也与术后胆道并发症的产生密切相关［36］。体内胆汁成分受ATP依赖性胆汁转运蛋白-胆汁盐转运体和多药耐药相关蛋白-3（multidrug resistance associated protein 3， MDR3）表达调控，它们分别负责胆汁盐和胆汁磷脂的分泌［37］。由于移植早期转运蛋白的数量减少以及胆管细胞内ATP不足而降低，转运蛋白的功能受到严重影响，从而导致高胆汁盐成分的异常胆汁形成［38］。这种异常胆汁盐具有强大的“清洗”作用，可通过破坏细胞脂质膜进入细胞后诱导细胞凋亡［29］。而采用机械灌注的方法可恢复线粒体功能并提高肝脏和胆管组织的ATP水平，恢复ATP依赖性胆汁转运蛋白-胆汁盐转运体的表达，平衡胆汁中胆汁盐和胆汁磷脂的比例，进而减少因异常胆汁引起的肝细胞和胆管上皮细胞的凋亡数量［29，36-38］。引起胆盐毒性的另一个因素是HCO3-分泌不足。ATP依赖型囊性纤维化跨膜转导调节因子（cystic fibrosis transmembrane regulator， CFTR）和 胆 管 细 胞Cl-/HCO3-交换体（anion exchanger 2， AE2）共同分泌的HCO3-用于维持胆管细胞附近正常的碱性环境［37］。在碱性环境中，疏水性胆汁盐被去质子化，使其不能通过脂质细胞膜渗透进入胆管细胞。而肝移植过程中由于胆管局部缺血引起的ATP依赖性CFTR和AE2功能受损，从而无法维持胆管细胞附近正常的碱性环境，从而造成胆管细胞损伤［29，37］。综上所述，采用机械灌注体外保存供肝的方法可恢复线粒体功能并提高肝脏和胆管组织的ATP水平，显著增加ATP依赖性胆汁转运蛋白-胆汁盐转运体以及ATP依赖性CFTR和AE2的数量，进而平衡胆汁中胆汁盐和胆汁磷脂的比例，减少高胆汁盐成分的异常胆汁，以及通过维持胆管细胞附近正常的碱性环境，减少进入胆管中的疏水性胆汁盐，从而共同减轻肝细胞和胆管上皮细胞的损伤。

3.3 机械灌注促进胆管上皮细胞的再生与修复：长期以来，人们一直认为胆管上皮内膜的IRI是NAS发展的主要决定因素［23-24］。但是，最近的临床研究表明，在所有移植肝中，超过90%的胆道上皮出现广泛损伤和缺失［27，40］。尽管腔内胆管壁出现大面积损伤，但这些肝脏中只有少数会导致移植后胆管病变。因此有人提出决定供体肝脏是否会发展为移植后胆管病的原因在于胆管上皮再生不足，而不是之前普遍认为的胆管损伤程度［41］。除了更好地保护胆管免受IRI外，机器灌注还使移植前供肝的胆管树再生和修复成为可能。尤其是在常温条件下，向灌注液内添加刺激胆管周围腺体内多能干/祖细胞增殖和成熟的药物，可以及时修复受损的胆管上皮细胞，从而阻止胆道并发症的产生［27］。由于胆管细胞易受ATP消耗的影响，并且大多数肝胆转运蛋白都是ATP依赖性的，因此可以认为机器灌注可以更好地保存和保护胆管［27］。

4 结 论

胆道并发症仍然是DCD肝移植术后最为严重的并发症之一，其高发病率与高死亡率严重影响患者术后的生活质量。肝移植术后胆道并发症的产生主要是多个相互关联的机制引发的损伤。由于常温机械灌注对器官的保存技术具有可以维持正常的线粒体功能，恢复肝内ATP浓度，减少ROS的产生等，从而减少移植后胆道并发症的发生，然而其机制仍值得进一步深入研究。