Jagged1促进乳腺癌发生发展及远处转移的研究进展

马补换 综述 刘彩霞 审校

乳腺癌是全球发病率最高的恶性肿瘤，已正式取代肺癌，成为全球第一大癌症，是导致女性死亡的主要癌症相关原因[1]。值得注意的是，晚期乳腺癌患者的死亡很大程度上归因于重要脏器的远处转移[2]，不仅威胁患者的生存预后，而且严重影响患者的生活质量，如脑转移会严重影响患者的认知、感觉功能[3]，如70%以上的骨转移患者会受到骨质疏松的影响，导致骨折、严重的疼痛和神经压迫等[4]。因此，深入研究并阐明乳腺癌远处转移的分子机制并探索有效的治疗方案是十分迫切和必要的。

越来越多的证据表明，Notch信号通路的异常激活与构成性活化在乳腺癌的发生发展中具有重要的驱动作用[5]。Jagged1(JAG1)作为Notch通路的重要配体之一[6]，已被证明可以通过多种作用机制激活Notch通路以促进乳腺癌的侵袭性进展与远处转移[7]。多项研究表明，通过RNA干扰技术沉默JAG1基因或者单克隆抗体靶向JAG1蛋白配体均可以显著抑制乳腺癌细胞生长，促进细胞凋亡[8]，显著抑制骨转移瘤[9]、脑转移瘤的生长[10]，以及逆转或改善肿瘤细胞对于化疗[9]、内分泌治疗等药物的耐药性[11-12]。重要的是，JAG1靶向性治疗并未展现出可检测到的严重毒副反应[9]。

1 JAG1基因位置与JAG1蛋白的结构

JAG1基因位于20号染色体，其细胞遗传学位置为20p12.2，基因组位置为(GRCh37)chr20：10，618，331-10，654，693。JAG1基因包含超过36 kb的26个外显子，可翻译产生由1 218个氨基酸组成的蛋白质。JAG1蛋白由相对较小的胞内区、跨膜区和较大的胞外成分组成。其胞外部分是其与受体结合发挥功能的主要区域，由四个维持蛋白质正常功能所必需的结构域组成，包括一个21个氨基酸的信号肽，一个由40个氨基酸组成的高度保守的DSL结构域，随后是16个表皮生长因子样(EGF-like)重复序列，以及一个半胱氨酸富集区[6]。信号肽确保蛋白质在细胞表面的正确定位，而DSL结构域是JAG1与Notch受体结合所必需的，EGF重复序列(特别是EGF重复序列1和2)对于提高JAG1与Notch受体的亲和力非常重要[6]。

2 JAG1促进乳腺癌远处转移的相关机制

2.1 JAG1促进乳腺癌细胞的上皮间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)、迁移和侵袭

既往已得到的证据表明，原位癌向浸润癌的进展与EMT的激活密切相关。在这个转化过程中，肿瘤上皮细胞在获得间充质特性的同时失去其粘附连接和细胞极性，被赋予癌症干细胞(Cancer stem cells，CSCs)的特性，进而获得较强的迁移侵袭能力以促进肿瘤进展[13]。E-cadherin的下调是人类乳腺癌EMT最好的标志物之一[14]。Leong等[15]研究表明，JAG1介导的Notch信号通路激活可以明显上调乳腺癌细胞中Slug的表达水平，Slug是一种转录抑制因子，通过下调E-cadherin的表达进而诱导乳腺癌细胞EMT，并且可以抑制乳腺癌细胞的失巢凋亡，最终促进肿瘤的侵袭和迁移。

值得注意的是，仅仅靠增强的迁移能力还不足以推动转移。大多数实体肿瘤嵌入在细胞外基质、基底膜和血管等构成的复杂网络，成为转移性肿瘤细胞必须克服的多个物理屏障[16]。尿激酶型纤溶酶原激活物(Urokinase-type plasminogen activator，uPA)是一种细胞外基质降解酶，与乳腺癌不良预后、较高的转移和复发风险相关[17]。一项研究表明，纤溶酶原激活物uPA是乳腺癌中JAG1-Notch受体信号通路的直接转录靶点，JAG1诱导Notch激活通过上调纤溶酶原激活物uPA，进而增强乳腺癌细胞侵袭能力，最终导致乳腺癌进展[18]。

2.2 促进血管生成与发育成熟

新生血管生成与成熟是肿瘤侵袭性进展所必需的过程之一。血管生成起始于内皮细胞的入侵，随后是一系列成熟步骤，包括管腔的形成和血管周围细胞的募集[7]。在血管萌发过程中，特定的内皮尖端细胞引导血管萌芽向血管内皮生长因子A(Vascular endothelial growth factor-A，VEGF-A)的浓度梯度方向生长[19]。当尖端细胞被选择并开始向前移动，随后相邻的茎内皮细胞开始增殖和迁移，新生血管的形成便开始了。这一过程受多种信号通路的调节，Notch信号通路占据核心地位。其中，DLL4和JAG1在新生血管生成过程中具有重要而相反的调节作用[20]。研究表明，被选择的内皮尖端细胞高表达DLL4，通过激活邻近茎内皮细胞Notch1信号，使VEGFR2的表达受到显著抑制[21]，降低了内皮细胞对VEGF-A的敏感性，因此DLL4/Notch信号限制了大量尖端细胞的出现，限制了过度发芽[22]。与DLL4不同，JAG1作为DLL4/Notch1通路的下游靶点之一，能够负反馈地下调血管新生内皮中的DLL4-Notch信号，是血管内皮尖端细胞形成和血管萌发的关键正调控因子[23]。另外血管茎内皮细胞表达的JAG1可以激活其他茎内皮细胞中的Notch4受体和邻近平滑肌细胞中的Notch3受体，积极驱动血管平滑肌细胞的分化和新生血管网的成熟[23]。一项研究发现[24]，内皮特异的JAG1基因缺失与新生血管的血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cell，VSMC)覆盖不良有关。血管内皮细胞表达的JAG1通过激活VSMC的Notch信号，诱导VSMC中αvβ3整合素的表达，进而与内皮细胞基底膜上富含的VWF结合，促进平滑肌细胞黏附，促进血管成熟。基因或药物干扰JAG1、Notch、αvβ3或VWF可抑制新生血管的平滑肌覆盖和血管发育过程中的动脉成熟[25]。值得注意的是，与存在的血管数量相比，肿瘤内新生血管的成熟状态对于肿瘤的发展更为重要，这些成熟血管具备向活跃分裂的肿瘤细胞有效输送营养和氧气的能力[26]。因此，靶向JAG1可通过促进肿瘤血管的“异常化”来抑制肿瘤的生长，可能与抗血管生成治疗具有协同作用以增强抗肿瘤治疗效果。

越来越多的证据表明，除了与血液灌注有关的作用外，肿瘤脉管系统在肿瘤微环境中也起着重要的作用。即内皮细胞通过血管分泌因子作用(如JAG1等)并影响邻近的肿瘤细胞，产生独特的细胞微环境，从而调节肿瘤干细胞样细胞的体内平衡，调节肿瘤的进展、侵袭和转移[27]。肿瘤微环境中血管内皮细胞表达的JAG1可以通过Notch1介导的旁分泌方式上调邻近乳腺CSCs中ZEB1的表达，进而维持肿瘤干细胞表型与募集，促进肿瘤生长[28]。在结直肠癌中，肿瘤微环境血管内皮细胞分泌可溶性JAG1，激活肿瘤细胞Notch信号通路，增加癌细胞的去分化，肿瘤干细胞样细胞扩增，并增加了体内移植的原代大肠癌细胞系的成瘤性和转移潜能。而通过敲除JAG1基因后使上述观察到的干细胞样表型消失[29]。

2.3 维持癌症干细胞表型

CSCs在乳腺癌中通常表现为CD44+CD24-/Low细胞亚群，这些细胞被认为对标准疗法有抵抗力的休眠或缓慢自我复制的细胞群体，通常被认为是导致患者复发和转移的原因[7]。在乳腺癌中，JAG1转录的高水平与乳腺癌干细胞自我更新增加有关。在小鼠模型中，乳房特异性缺失Lfng(一种N-乙酰氨基葡萄糖转移酶，可阻止JAG1激活Notch)可以诱导具有更高JAG1活性和促进CSCs增殖的基底样乳腺癌[30]。

除肿瘤细胞来源的JAG1，肿瘤微环境中多种间质细胞来源的JAG1在乳腺癌侵袭性进展中也发挥不可替代的作用。值得注意的是，CSCs在肿瘤内的分布并不均匀，但在血管周围的壁龛中相当丰富，这表明CSCs与它们的肿瘤微环境密切相关。Jiang等[28]证明肿瘤微环境中相关内皮细胞表达的JAG1可以通过Notch1介导的旁分泌方式上调邻近乳腺CSCs中ZEB1的表达，ZEB1已被证实参与肿瘤干细胞特性的获得[31]，另外肿瘤细胞中ZEB1的表达上调可促进VEGF-A的生成，并以旁分泌的方式相互诱导内皮细胞JAG1的表达，这种正反馈回路被发现促进了肿瘤的生长[28]。此外，脑转移微环境中反应型星形胶质细胞来源的JAG1、化疗诱导的成骨细胞来源的JAG1和内分泌治疗诱导的肿瘤细胞表达的JAG1均可激活CSCs中的Notch通路，进一步募集CSCs或促进CSCs的自我更新以促进乳腺癌的侵袭性进展及耐药的发生，而抑制或阻断JAG1-Notch信号通路可以使CSCs数量明显下降[3，9，11]。

2.4 参与内分泌治疗耐药性产生

研究表明，50%～60%的早期乳腺癌患者和几乎所有晚期乳腺癌患者都会对内分泌药物产生新的或获得性耐药，已经成为乳腺癌病人生存的严重障碍之一。Simoes等[11]研究发现，在雌激素受体阳性(ER+)乳腺癌中，给予他莫昔芬或氟维司群治疗后可激活JAG1-Notch4信号通路，并募集乳腺癌干细胞(Breast cancer stem cells，BCSCs)，而BCSCs多为JAG1+/NOTCH4+/ALDH1+/ER-的细胞亚群，对雌激素受体阻断剂选择性耐药。研究表明，Notch信号参与肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophages，TAM)的分化调节[32]。其中M2型TAMs通过刺激肿瘤增殖、侵袭和血管生成以促进转移[33]。经芳香化酶抑制剂处理后的乳腺癌细胞中JAG1表达明显上调，并且JAG1上调水平的增加可激活Notch信号通路，导致TAMs向M2型TAMs的分化逐渐增加[32]，促进转移的发生。研究发现，PKCα是人表皮生长因子受体-2(HER-2)信号通路的一个下游产物，PKCα抑制JAG1和E3泛素连接酶(Mind Bomb-1)之间的相互作用，阻止JAG1的泛素化以及随后的Notch激活。然而予以曲妥珠单抗靶向治疗阻断HER-2通路后，PKCα水平显著下降，对JAG1泛素化的抑制作用被逆转，使JAG1激活Notch信号通路，促进乳腺癌的侵袭与进展，从而对曲妥珠单抗等靶向药产生耐药性[34]。Shah等[12]研究发现，HER-2的过度表达和过度活性状态可以特异性地限制BCSCs细胞膜表面JAG1的高表达状态。当使用拉帕替尼使HER2失活后，使得乳腺癌细胞膜表面低JAG1表达转变为高JAG1表达状态，从而导致BCSCs增殖，导致对拉帕替尼耐药以及具备更高的肿瘤启动潜能。

3 JAG1与乳腺癌脑转移

脑是晚期乳腺癌常见的转移靶点之一，大约15%～30%的转移性乳腺癌患者在病程中会发生脑转移[35]。乳腺癌脑转移发生率与乳腺癌细胞分子分型相关，三阴性乳腺癌亚型(Triple negative breast cancer，TNBC)与中枢神经系统转移的发生密切相关，脑转移发生率高达30%～40%[36]。当循环肿瘤细胞转移到远处的器官时，他们需要重新建立微环境来产生一个合适的生态位并激活参与肿瘤发生的相关信号通路[37]。Xing等[3]发现，转移到大脑的乳腺癌细胞通过激活反应型星形胶质细胞高表达JAG1，进而激活BCSCs的Notch信号通路，显著增强BCSCs细胞的自我更新，为BCSCs在大脑生存建立适合的微环境，最终导致乳腺癌脑转移发生。在脑转移性动物实验中，当JAG1mAb同时靶向肿瘤和间质表达的JAG1时，可以显著及稳定地抑制异种移植模型中肿瘤的生长，并抑制脑转移型小鼠模型的发生发展。另外，在TNBC脑转移大鼠模型亦观察到同样的抗肿瘤现象[10]。

4 JAG1与乳腺癌骨转移

骨转移是乳腺癌患者的主要健康威胁之一，70%以上的骨转移患者会受到骨质疏松的影响，导致骨折、严重的疼痛和神经压迫[9]。Sethi等[4]研究表明，肿瘤源性JAG1是介导肿瘤与间质相互作用并促进溶骨性骨转移的中心节点。表达JAG1的肿瘤细胞通过激活成骨细胞的Notch信号通路刺激其释放IL-6以促进肿瘤细胞生长，另外高表达JAG1肿瘤细胞促进破骨细胞的分化与成熟，促进溶骨性骨转移的发生[4]。敲除或沉默JAG1表达后可显著延长小鼠的生存期和推迟骨转移开始时间，减轻小鼠骨肿瘤负荷[4]。基于上述研究，进一步研究表明，多种化疗药物(紫杉醇和顺铂)处理后，可诱导成骨细胞和间充质干细胞JAG1的表达上调，进而反馈给肿瘤细胞激活Notch信号促进肿瘤进展与化疗耐药[9]。而该团队研制的全人源化JAG1单克隆抗体(15D11)，可以显著降低乳腺癌细胞和成骨细胞来源的JAG1的水平，这一策略与紫杉醇或卡铂的辅助化疗相结合，极其有效地减弱了骨转移种植和肿瘤的化疗耐药性。这些发现证实了JAG1是乳腺癌骨转移过程中的重要驱动力，因此靶向JAG1是一种潜在的预防或治疗骨转移的重要手段，可减少骨转移并使其对化疗敏感。

5 JAG1靶向治疗的相关策略

5.1 基因沉默

在体内外实验中，由腺病毒或慢病毒载体导入的JAG1小干扰RNA(siRNA)或短发夹RNA(shRNA)被广泛用于抑制JAG1基因的功能，从而抑制表达JAG1细胞的致瘤和促血管生成能力[38-40]。研究表明，通过shRNA技术沉默JAG1后，可以观察到乳腺癌MDA-MB-231细胞的生长速度明显减缓，细胞周期停滞于G0/G1期，凋亡率升高[8]。值得注意的是，Steg等[38]使用JAG1 siRNA-壳聚糖纳米颗粒递送系统以敲降JAG1基因，带正电的纳米颗粒允许siRNA通过细胞膜运输，并且具有可生物降解的、生物相容性好和免疫原性低等特性，被认为是一种有效在体内阻断Notch信号的方法。

5.2 干扰JAG1/Notch信号级联

除了直接沉默JAG1基因外，另一种针对JAG1的策略是通过干扰JAG1-Notch信号转导过程而发挥抑瘤作用。泛素化对于JAG1-Notch通路激活是必不可少的，它依赖于Neuralized1(Neurl1)和Mind Bomb-1(Mib1)两个E3泛素连接酶[41]。Neurl1过表达下调JAG1-Notch信号，从而促进髓母细胞肿瘤细胞凋亡，抑制神经球和肿瘤生长[42]。相反，Mib1促进JAG1-Notch信号的激活，并有助于乳腺癌细胞的存活和耐药性[34]。恢复Neurl1表达或抑制Mib1表达已被证明能抑制乳腺癌细胞的致瘤性和肿瘤生长[34]。Dynamin是JAG1内化的内吞接头，对JAG1介导的Notch蛋白水解至关重要，用动力蛋白的细胞渗透性抑制剂DATORE处理卵巢癌细胞，可显著降低NICD并促进细胞凋亡[43]。

5.3 靶向性抗体

为了直接消除JAG1的功能，Zheng等[9]利用XenoMouse技术研制出一种全人源化JAG1单克隆抗体(15D11)，以降低乳腺癌细胞和成骨细胞来源的JAG1的水平。15D11可以显著抑制表达JAG1的乳腺癌细胞导致的体内骨转移，并且可以改善或逆转骨转移患者化疗过程中耐药性的产生。当与化疗药物(卡铂或紫杉醇)联用时，在骨转移小鼠模型中观察到骨转移负担几乎减少了100倍，并且显著逆转及改善了肿瘤的化疗耐药性[9]。除了15D11之外，最近的一项研究还开发了另一种针对JAG1蛋白DSL-EGF1-3结构域的人源JAG1-mAb，并被证明成功地阻断了JAG1-Notch的相互作用[10]。在体外3D培养条件下，这些抗体抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞的生长，并显著减少CSCs细胞数量。在脑转移性动物实验中，当JAG1mAb同时靶向肿瘤和间质表达的JAG1时，这些抗体可以有效抑制MDA-MB-231异种移植大鼠模型中的肿瘤生长，以及显著而稳定地抑制脑转移大鼠模型的发生发展，在TNBC脑转移大鼠模型中亦可观察到类似的抗肿瘤效果[10]。与15D11相似，并没有检测到这些单抗的毒性，这支持了它们进一步进行临床前和临床研究的潜力[10]。

另外，研究表明，内分泌疗法处理ER+或者HER-2+乳腺癌细胞可以特异性地增加JAG1表达，进一步募集BCSCs、促进BCSCs的自我更新或改变肿瘤微环境中浸润细胞的分化调节，通过上述机制促进内分泌治疗耐药[11-12，32]。因此内分泌疗法与靶向JAG1治疗联用极可能具有良好的临床前景，为逆转或改善内分泌治疗的耐药性做出一定贡献，但有待进一步研究证实。JAG1亦与肿瘤血管的生成、发育成熟以及抗血管治疗耐药性密切相关。以血管内皮生长因子诱导的血管生成为靶点的贝伐珠单抗治疗已经对各种癌症类型产生了深远的影响，但在临床前和临床环境中经常观察到耐药现象[44]。血管周细胞对肿瘤血管的覆盖增加以维持其完整性，这一过程被认为是导致抗血管生成治疗抵抗的主要机制之一[45]。因此，内皮表达的JAG1在血管平滑肌以及血管周细胞生物学中的作用表明，靶向JAG1可能与抗血管生成方法具有有益的协同效应。抗JAG1靶向疗法有望成为未来的治疗策略，无论是在TNBC还是其他类型的癌症中都是如此。

5 小结与展望

尽管乳腺癌的治疗取得了成功，但大多数晚期患者总是会发展成致命的转移性病变，这是目前急需解决的重要难题之一。肿瘤细胞或非肿瘤细胞表达的JAG1与其他致癌途径共同驱动的Notch信号，通过调节肿瘤细胞的特性，主要包括细胞增殖、侵袭和迁移、血管生成、肿瘤干细胞数量维持、内分泌和化疗耐药等，从而促进肿瘤侵袭性进展和远处转移[7]。JAG1作为一种新型的阻断Notch信号的候选分子具有更大的治疗窗，并且可有效避免全身Notch抑制剂(如γ-分泌酶抑制剂-GSI)固有的剂量限制毒性[46]。多项研究表明，JAG1mAb显著抑制肿瘤生长，减少动物模型中脑转移、骨转移的负荷并延后转移开始的时间，显著增加对化疗的敏感性[9-10]。另外，JAG1与内分泌治疗及抗血管生成治疗的耐药性密切相关[11-12，44-45]，因此，如果将JAG1与目前的治疗(化疗、内分泌治疗、抗血管生成治疗)相结合，或许不仅可以强化抗肿瘤效果，亦可以逆转或减弱这种治疗耐药性，实现双赢的效果，为晚期乳腺癌患者治疗提供较好的前景。值得进一步的研究与探讨。