骨肉瘤基因治疗进展

李哲宏 甘新天 白磊鹏 吕家兴 曹海营 徐 莹金 宇

( 1 承德医学院研究生院2019级 ， 河北 承德 067000 ； 2 承德医学院附属医院创伤骨科 )

骨肉瘤(Osteosarcoma OS)是20岁以下儿童、青少年好发的骨原发性恶性肿瘤，恶性度高、预后差。目前骨肉瘤治疗主要以大剂量个体化新辅助化疗(在术前化疗)和手术治疗为主，但治疗后仍具有病情进展快、病灶转移早、肿瘤易复发、治疗困难等特点[1]。对抗骨肉瘤需要新的策略，而基因治疗技术为攻克骨肉瘤提供了新的可能。基因治疗是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病，以达到治疗目的[2]。20世纪 60 年代美国分子生物学家Lederberg J首次提出基因治疗的初步概念，为基因治疗的发展奠定了基础[3]。近20年来人类基因组学的进展表明，骨肉瘤是由宿主体细胞基因组异常介导而产生的[4]。自1990年开始，数据显示在过去20年时间内全球范围内进行了近2600个各种基因疗法临床试验，直到近10年才体现出基因治疗显著的临床益处，尤其是免疫缺陷病、血液系统疾病以及肿瘤领域[5-6]。目前研究骨肉瘤的基因治疗在基础与临床均取得了巨大进展，现对骨肿瘤的基因治疗最新进展综述如下。

1自杀基因治疗：自杀基因治疗又称为基内导向性酶前体药物治疗，其原理为将肿瘤细胞或其附近的细胞修饰，使其表达自杀基因，通过使用肿瘤特异性调控元件(启动子)使药物仅在肿瘤细胞中被激活，使得肿瘤细胞产生细胞毒性物质，从而导致携带该基因的受体细胞被杀死[7]。自杀基因介导的肿瘤基因治疗还具有“旁观者效应”，即导入有自杀基因的肿瘤细胞对邻近的未导入自杀基因的肿瘤细胞也有杀伤作用[8]。现阶段，胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶系统(CD/5-FC)、单纯疱疹病毒-胸腺晓啶激酶/无环鸟苷系统(HSV-TK/GCV)已经运用到骨肉瘤试验性治疗且取得一定进展[9]。Wang Y等[8]发现由激素受体酶启动子驱动的反义血管内皮生长因子表达与缺氧相结合，可以抑制人骨肉瘤细胞中血管内皮生长因子的表达，从而提高HSV-TK / GCV系统的选择性杀伤作用和旁观者效应。Zhang D 等[10]发现泛素相关修饰物拓扑酶Ubc9蛋白(Ubc9)在骨肉瘤中的过表达，通过小干扰RNA(siRNA)沉默Ubc9可以抑制骨肉瘤细胞的增殖和迁移，并显著提高细胞对HSV-TK的敏感性。NguyenThai QA等[11]检测发现表达胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶前药(CD/5-FC MSCs)的人骨髓间充质干细胞(MSCs)对人骨肉瘤细胞系Cal72的靶向性。随着更转染技术的提高、有效自杀基因的发现，骨肉瘤的自杀基因治疗有着更加广阔的前景。

2基因沉默治疗：基因沉默是特定基因的表达量下调或表达受到抑制，指的是在肿瘤治疗中由双链RNA诱导的识别和清除细胞非正常RNA，诱导肿瘤细胞凋亡、降低其侵袭能力的一种手段。目前研究表明，基因沉默主要有2种，转录水平上的基因沉默和转录后基因沉默。前者主要通过基因甲基化、位置效应、同源基因的反式失活、后成修饰作用以及重复序列使得肿瘤细胞基因沉默；后者主要通过共抑制和RNA干扰使得肿瘤细胞基因沉默。目前基因沉默在骨肉瘤治疗中有着长足的进展，Han Y等[12]研究发现，沉默FOS样抗原-1基因、Xi LC 等[13]研究发现皮肤桥蛋白(DPT)均可抑制骨肉瘤细胞的增殖、侵袭和迁移，FOS样抗原-1基因同时可以下调ERK / AP-1信号通路而下调了骨肉瘤相关基因的表达。Jin PY[14]等研究57例骨肉瘤患者的骨肉瘤细胞，发现DNA依赖性蛋白激酶复合催化亚基(DNA-PKcs)对骨肉瘤MG-63细胞凋亡，增殖，迁移和侵袭起抑制作用。Chen D 等[15]人研究发现SOx4基因沉默后，骨肉瘤细胞中Bax，Caspase-3和P53的蛋白表达水平明显升高，而Bcl-2，MMP2和MMP9的蛋白表达水平明显降低。实验裸鼠体内分析进一步证实，敲除SOx4可抑制骨肉瘤的生长。Liu J等[16]实验发现，抑制泛素特异性蛋白酶1可下调多种蛋白的表达，尤其是SIK2，紧接着SIK2的RNAi显著降低SIK2蛋白的表达，抑制集落形成能力，诱导凋亡，降低骨肉瘤细胞的侵袭力。目前基因沉默技术具有特异性、高效性、靶点的多样性与选择性等特点，有望给肿瘤的治疗带来革命性的进展。

3抑癌基因治疗：抑癌基因是一类存在于正常细胞内可抑制细胞生长并具有潜在抑癌作用的基因。抑癌基因在控制细胞生长、增殖及分化过程中起着十分重要的负调节作用，它与原癌基因相互制约，维持正负调节信号的相对稳定。而骨肉瘤最常见的特征是基因组紊乱，染色体改变的非整倍体，肿瘤抑制基因和细胞周期的放松调控，以及缺乏DNA修复[17]。骨肉瘤的发生与成骨过程中参与抑癌基因甲基化失活导致监视失败、缺乏DNA修复或抑制凋亡有关[18]。p53基因全长约20kb，定位于人染色体17p13，转录成2.5kb mRNA，编码393个氨基酸组成的蛋白，相对分子质量约为53KD。p53基因由11个外显子和10个内含子组成，外显子2、4、5、7、8分别编码5个进化上高度保守的结构域。p53基因自发现以来，一直都是备受关注的热点抑癌基因，作为对各种细胞信号的响应，肿瘤抑制蛋白p53激活了一系列基因，这些下游的microRNAs促进了基因组完整性的维持、细胞周期停滞、细胞衰老和凋亡[19]。有报道称[18]，在骨肉瘤来源的细胞系中，p53靶基因以及活性受p53调控的基因，由于其启动子的高甲基化而被沉默，而导致的基因组紊乱，诱导骨肉瘤的发生。最新研究发现,Jun激活结构域结合蛋白1(Jun1)在体内的过表达，以p53依赖的方式加速自发肿瘤的形成，故Jun1可以成为治疗骨肉瘤的靶点之一[20]。Yang J等[21]实验证明热休克蛋白90(HSP90)被烯丙基氨基17-去甲氧基格尔德霉素(17-AAG)抑制，其可通过β-catenin/ runt相关转录因子2(Runx2)信号传导抑制骨肉瘤细胞生长。Lin JT等[22]利用壳聚糖接枝聚修饰人类免疫缺陷病毒-1转录反式激活因子，可同时将p53和阿霉素共转导入细胞核，从而在体内外有效地消除癌细胞，发挥其抗肿瘤作用。Rb基因全长约200kb，定位于人染色体13q14，转录成4757bpm RNA，编码928个氨基酸组成的蛋白，相对分子质量约为110KD。Rb基因由有27个外显子和26个内含子组成，外显子与内含子交界处是保守的GT-AT序列。RB基因是人类癌症中最常见的突变基因之一。经典途径：RB通过调节E2F转录因子的活性，通过调节细胞周期进程中的G1 / S期过渡发挥其肿瘤抑制活性。然而，当肿瘤发生转移、增殖、耐药时，最容易检测到的就属RB基因的畸变[23]。Kashuba E等[24]实验发现RB结合蛋白MRPS18-2(S18-2)在原代成纤维细胞中的过表达导致其永生化，并伴随着胚胎干细胞标志物的诱导和最终的恶性转化，抑制S18-2可以达到抑制骨肉瘤细胞增殖生长。同时临床研究发现，视网膜母细胞瘤(RB)-E2F通路的激活与否与临床预后较差的分子亚型之间存在显著的关联，即该通路定义了骨肉瘤的分子表型，为临床筛选敏感药物、治疗提供了靶向支持[25]。Wang TX等[26]用RNA22程序预测，构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络，并用Cytoscape软件进行可视化。鉴定出47个下调的高甲基化基因和3个上调的低甲基化基因，这些基因可能参与骨肉瘤的发生、发展和转移，为潜在的预后生物标志物和治疗靶点。Kreahling JM等[27]临床观察中发现，MK1775作为单一治疗药物时，所有被测试的骨肉瘤中都会进入有丝分裂和启动凋亡细胞死亡。MK1775可以抑制丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶导致显着的骨肉瘤细胞的凋亡。

4免疫基因治疗：免疫基因治疗是通过增强免疫系统的识别能力、增强免疫系统的机能，从而达到抑制肿瘤的增长、侵袭转移及复发。先天性和适应性免疫在抑制肿瘤生长中起着至关重要的作用，先天性免疫细胞通过直接识别和杀死或通过自我激活触发强烈的适应性免疫反应2种机制来实行肿瘤抑制[28]。针对骨肉瘤的免疫基因治疗，Tellez-Gabriel M等[29]认为，骨肉瘤的特征之一为免疫细胞浸润，包括T和B淋巴细胞，NK细胞，多核细胞和巨噬细胞。Lussier DM 等[30]发现，a-CTLA-4和ax-PD-L1抗体在转移性骨肉瘤的K7M2小鼠模型中具有阻断作用，阻断可以通过增强机体对肿瘤的清除率而改善K7M2小鼠的生存率。血管内皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(VEGFR-TKI)是小分子抗肿瘤血管生成的药物，免疫检查点则是防止免疫系统过度激活的一致性通路，能够在免疫反应过度时对信号通路进行关闭。Duan XL等[31]发现，使用VEGFR-TKI和免疫检查点抑制剂的联合治疗骨肉瘤荷瘤小鼠，其联合疗法抑制信号传导及转录激活因子3的活化来降低PD-L1的表达，并抑制骨肉瘤细胞的迁移和侵袭，减少了荷瘤小鼠的肺转移，肿瘤生长，改善了生存率并逆转了肿瘤微环境。免疫基因理想的治疗方式应具备安全、价廉、性质稳定等特点。免疫基因治疗通过影响基因表达改变了体内肿瘤微环境，激活自身的免疫功能杀伤肿瘤细胞，有着广阔的临床前景。

5抗血管生成基因治疗：在周围血管的支持下，细胞毒性药物虽然可以杀死肿瘤细胞，但残存肿瘤细胞仍可获得血供而得以继续生长。同时，异常的肿瘤血管使药物向肿瘤组织内部递送减少，最终导致治疗效果受限。抗血管生成治疗以肿瘤新生血管为作用靶点，切断肿瘤生长转移所需要的“营养供应”从而达到“饿死”肿瘤的目的。与仅作用于肿瘤细胞增殖的化疗药物不同，通过与血管内皮生长因子特异性结合，阻止其与受体相互作用，发挥对肿瘤血管的多种作用：使现有的肿瘤血管退化，从而切断肿瘤细胞生长所需氧气及其他营养物质；抑制肿瘤新生血管生成，从而持续抑制肿瘤细胞的生长和转移[32]。Li YS等[33]在研究中发现，在骨肉瘤中，金属蛋白酶MMPs过度表达，其过度表达导致肉瘤细胞在远处(主要是在肺部)存活，生长并产生转移灶的关键性要素。Hadjimichael AC等[34]发现，多西环素通过抑制MMP功能阻止细胞外基质和基本膜降解，使得骨肉瘤细胞丧失了侵袭和转移能力。此外研究还发现多西环素消除分泌血管内皮生长因子的抗血管生成作用，使得肿瘤缺乏营养供给。抗血管生成基因通过抑制骨肉瘤滋养血管，阻断骨肉瘤营养供给，有效阻断了肿瘤的生长转移。

问题与展望：基因治疗作为一崭新的治疗手段，为肿瘤患者带来希望，但其运用从基础实验到临床应用仍有很长的一段路需要走，回顺基因治疗骨肉瘤的进展，其诞生以来所走过的道路，基因治疗还面临很多问题与挑战，包括基因组编辑发生脱靶效应,从而导致不同程度的副作用、毒性或动力学改变，如何提高基因递送和编辑效率以精确治疗骨肉瘤，基因转移效率高导致的严重毒性等。虽然基因治疗目前存在一定的问题，但随着科技发展，基因治疗的关键技术将会不断得到突破和解决。未来几年是全球肿瘤基因治疗技术突破重点时，基因治疗或将成为骨肉瘤治疗不可或缺的一部分。